細胞生長曲線(cell growth cilrve)是測定細胞增長數(shù)值和生長繁殖基本規(guī)律常用的簡便方法，是研究細胞在一代生存期內(nèi)的增殖過程的重要指標。常用方法有細胞計數(shù)法。它以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞密度為縱坐標。細胞生長曲線可用于分析細胞增殖速度，確定細胞傳代、細胞凍存或具體實驗的時間。細胞增殖曲線的測定一般可利用細胞計數(shù)法進行。

一、細胞計數(shù)法

(一)材料

1．待測細胞懸液。

2．24孔培養(yǎng)板。

3．消化液：O．25％*和O．0256 EDTA混合消化液。

(二)方法

1．培養(yǎng)細胞取生長狀態(tài)良好的細胞，制成細胞懸液，經(jīng)計數(shù)并記錄接種的細胞懸液之密度后，在培養(yǎng)板的21個孔內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細胞(如果使用培養(yǎng)瓶，則需接種21瓶)。接種時間記為0h。

2．計數(shù)細胞密度從接種時問起，每隔24h吸棄3孔中培養(yǎng)液，加入消化液，混懸細胞并計數(shù)3孔(瓶)內(nèi)的細胞密度，求平均值。為提高準確率，對每孔(瓶)細胞可計數(shù)2～3次。如此操作至第7d結(jié)束。

3．繪制曲線以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標，標出各點并連成線，即得所培養(yǎng)細胞的增殖曲線。

(三)結(jié)果分析

    細胞增殖曲線反映細胞的生物學特征，標準的曲線呈近似“S”形。每一代細胞的生長過程可大致分為潛伏期、對數(shù)生長期和停滯期。一般在傳代后*天細胞數(shù)有所減少，經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期后進入對數(shù)生長期，達到平臺期后生長穩(wěn)定，zui后到達衰老。

1．潛伏期是細胞對分離和傳代操作所致的損傷的恢復以及適應(yīng)新生長環(huán)境的過程。原代培養(yǎng)細胞需要24～96h。，甚至更長時間才能恢復增殖。不同細胞的增殖恢復所需的時間不同，如腫瘤細胞比二倍體細胞恢復得快。傳代細胞的潛伏期一般為6～24h。

2．對數(shù)生長期細胞數(shù)量呈對數(shù)增長，對數(shù)生長期一般為3～5d，常以倍增時間(即生長曲線上細胞數(shù)量增加一倍的時間)來表示細胞生長旺盛情況。細胞生長倍數(shù)則是指測定接種時活細胞的濃度，經(jīng)一個生長周期達到zui大活細胞濃度的比率。細胞傳代、指標測試等多在此區(qū)間進行。

3．停滯期細胞不再增殖，生長活動停滯。

(四)注意事項

1．培養(yǎng)板各7L內(nèi)細胞的消化操作過程要一致，以免造成細胞濃度的明顯差別。

2．計數(shù)前，應(yīng)盡量使細胞混懸均勻。每孔內(nèi)加入的細胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致。

3．細胞接種數(shù)量應(yīng)適宜。一般接種數(shù)量以7～10d能長滿而不發(fā)生生長抑制為宜。數(shù)量過少將導致細胞適應(yīng)期延長，數(shù)量過多易使細胞快速進入增殖穩(wěn)定期。

4．細胞增殖曲線可有20％～30％的誤差，需較反映生長數(shù)值時，需結(jié)合其他指標進行分析。

二、WST一8檢測法

    WST-8是一種新型的水溶性四唑鹽，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成具有高度水溶性的橙黃色甲臌產(chǎn)物，其顏色的深淺和活細胞的數(shù)量呈正比。含WST一8成分的CCK 8(cell counting kit一8)試劑盒已廣泛應(yīng)用于檢測細胞增殖和細胞毒性。其檢測方法簡單介紹如下：

(一)材料

1．待測細胞。

2．96孔培養(yǎng)板。

3．10％FBS培養(yǎng)溶液。

4．CCK 8試劑盒。

5．酶聯(lián)免疫檢測儀。

(二)方法

1.96孔板中每孔加入200 μl含10％FBS的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，并進行實驗分組。

2．每隔24h酶聯(lián)免疫儀測定各組細胞在450nm波長處的吸光度值，連續(xù)監(jiān)測7次。

(三)結(jié)果分析

    計算各個實驗分組的吸光度值的平均值，設(shè)時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線。

(四)注意事項

    為了獲得更為可靠的實驗數(shù)據(jù)，應(yīng)至少重復3次實驗，以提高實驗結(jié)果的可靠性。