化學致癌物誘導細胞轉(zhuǎn)化實驗

(1)原理：化學致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化學物質(zhì)引起或誘導正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)展成腫瘤的過程。通過細胞表型的改變，反映各種理化因素的致癌性，同時，可模擬化學致癌物在體內(nèi)致癌的過程，并可對發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞做直接觀察和各種分析。其中以敘利亞地鼠胚胎初代培養(yǎng)細胞較為常用，現(xiàn)在以N一甲基一N'一硝基一N一亞硝基胍(MNNG)進行細胞轉(zhuǎn)化實驗為例。

(2)材料

1)動物：鼠(如：敘利亞地鼠，金倉鼠等)。

2)細胞生長液：含20％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養(yǎng)液。

3)維持液：含5％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養(yǎng)液。

4)消化液：O．25％*(含O．01％EDTA)。

5)凍存液：含lO％小牛血清的DMSO。

6)致癌劑：MNNG。

7)洗液：PBS。

(3)方法

1)取材：妊娠第13天鼠，取數(shù)個同窩胚胎，去頭和內(nèi)臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用0．25％*(含O．Ol％EDTA)37℃消化30min，濾過，低速離心，吸除消化液，加入營養(yǎng)液制備成細胞懸液，接種人75cm培養(yǎng)瓶中，接種密度為10～20×106／75 cm，37℃培養(yǎng)2～3d。

2)貯存：選大批生長狀態(tài)良好的細胞凍存。

3)致癌物處理：取凍存細胞，解凍后接種于25ml培養(yǎng)瓶中，每瓶含細胞10萬～30萬。待細胞生長進入指數(shù)增生期時，加入含0．5～1．Omg／L MNNG的*培養(yǎng)基，在37℃孵箱中培養(yǎng)12～48h。

4)低血清培養(yǎng)：棄掉MNNG致突變劑，用溫PBS洗2～3次，加入含20％小牛血清，繼續(xù)置溫箱中培養(yǎng)2～3周，然后改用含5％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。低血清培養(yǎng)液不利于正常細胞牛長，但已轉(zhuǎn)化的細胞仍能增殖和形成轉(zhuǎn)化灶。

5)轉(zhuǎn)化灶的形成：用致癌物處理過的細胞于10d后在正常細胞之間，可產(chǎn)生數(shù)量不等的轉(zhuǎn)化灶。轉(zhuǎn)化灶由密集而重疊的細胞組成。在透光檢查時，肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉(zhuǎn)化灶。顯微鏡下觀察，未轉(zhuǎn)化的成纖維細胞轉(zhuǎn)化后，胞體增大，成多邊形，生長無方向性，失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細胞相互重疊。在轉(zhuǎn)化灶邊緣，轉(zhuǎn)化細胞與正常細胞界限分明，形態(tài)區(qū)別相當明顯。上皮細胞轉(zhuǎn)化后形態(tài)變化不如成纖維細胞差別大，需仔細識別。

6)轉(zhuǎn)化細胞的分離：將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化細胞，將轉(zhuǎn)化灶用記號筆標記。用細胞刮去除未發(fā)生轉(zhuǎn)化的外圈正常細胞。向瓶內(nèi)加入PBS清洗3次，再加入消化液．37℃下消化數(shù)分鐘。鏡下觀察細胞變圓時，加人含10%小牛血清的*培養(yǎng)液，反復用吸管吹打分散，制成細胞懸液，分瓶培養(yǎng)。成單層后，再用傳代法擴大培養(yǎng)。

(4)轉(zhuǎn)化細胞觀察與鑒定：轉(zhuǎn)化灶由密集而重疊的細胞組成。肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉(zhuǎn)化灶。顯微鏡下觀察，成纖維細胞轉(zhuǎn)化后，胞體增大，成多邊形，生長無方向性．失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細胞相互重疊。在轉(zhuǎn)化灶邊緣，轉(zhuǎn)化細胞與正常細胞界限分明，形態(tài)區(qū)別明顯。上皮細胞轉(zhuǎn)化后形態(tài)變化不如成纖維細胞差別大，需仔細識別。