ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此,應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。抗體

加樣

    加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍）按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
    每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。
樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩混勻。
    如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去*滴有氣泡的試劑后加樣。

溫育
    抗原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下（37°C），經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間才能達(dá)到反應(yīng)的平衡點(diǎn)
    ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能 使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。
    邊緣效應(yīng)（2ng/mlHBsAg一步法三種不同溫育法的結(jié)果）
洗滌
    ELISA是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物的目的，同時(shí)洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細(xì)菌中的酶干擾清除掉。
手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內(nèi)反應(yīng)液；2）用洗滌液過(guò)洗一遍（即注滿孔后即甩去）；
3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動(dòng)；4）甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。
    重復(fù)以上操作至少5次。注意各種ELISA試劑盒的洗滌液盡量不要混用。
    洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時(shí)要設(shè)置一定的浸泡時(shí)間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時(shí)應(yīng)再用手工洗2次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。

顯色
    HRP催化底物的一步呈色反應(yīng)，同樣需要一定的時(shí)間和溫度， 一定要按照說(shuō)明書(shū)規(guī)定的時(shí)間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應(yīng)后終止或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達(dá)0.2左右使的時(shí)間而恒定反應(yīng)時(shí)間.

酶標(biāo)儀判讀結(jié)果
    顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（30分鐘內(nèi)）。
    常見(jiàn)的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者zui為常見(jiàn)，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色，測(cè)定波長(zhǎng)為490nm；TMB終止后顯黃色，測(cè)定波長(zhǎng)為450nm，二種底物的校正波長(zhǎng)均用630nm。

    使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應(yīng)板應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。抗體