一、實(shí)驗(yàn)原理
這種蛋白質(zhì)測定法是zui靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用zui廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的*和苯*殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。
folin—酚試劑法zui早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時間較長，要控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、*、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1～2倍。
進(jìn)行測定時，加folin—酚試劑時要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性ph條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在ph=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。
此法也適用于*和*的定量測定。
此法可檢測的zui低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20~250mg。
二、試劑與器材
1. 試劑
① 試劑甲：
（a）10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉 （KNaC4H4O6-4H2O）。溶解于500毫升蒸餾水中。
（b）0.5克硫酸銅（CuSO4-5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（a）與1份（b）混合，即為試劑甲。
② 試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO4-2H2O），25克鉬酸鈉（Na2MOO4-2H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入150克硫 酸 鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，*作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使zui終的酸濃度為1n左右。
③ 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%nacl溶液。
2. 器材
① 可見光分光光度計(jì)
② 旋渦混合器
③ 秒表
④ 試管16支
三、操作方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的*支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
注意：因lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計(jì)時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待zui后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。
進(jìn)行多試管操作時，為了防止出錯，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。zui下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的吸光度值。
folin—酚試劑法實(shí)驗(yàn)表
管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（250mg/ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
未知蛋白質(zhì)（約250mg/ml） 0.2 0.4 0.6
蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4
試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管中蛋白質(zhì)的量（mg）
吸光度值（a700）
2. 樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定放在一起，同時進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。
根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。
注意:由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的*和苯*，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。
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