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單層生長細胞的免疫熒光標記實驗

閱讀:254發(fā)布時間:2015-05-27

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實驗材料    單層細胞
試劑、試劑盒    PBS多聚甲醛甲醇抗體
儀器、耗材    離心機水浴鍋培養(yǎng)箱
實驗步驟    
1.  置生長成片的單層細胞于冰上冷卻,吸去培養(yǎng)液并以4℃PBS洗滌。吸去PBS。

2.  如欲研究細胞表面抗原,則以2%PFA于冰上面定30 min。如為細胞質(zhì)抗原,則可用含0.1% Triton X-100的2%PFA于冰上固定30 min,或以*甲醇在普通冰箱的結(jié)凍室(-10~-20℃)固定15 min。
 
3.  吸去固定液,用4℃PBS洗2次(毎次5 min)。稀釋的笫一抗體于4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min。
 
4.  加*抗體于培養(yǎng)皿中,使其恰好覆蓋細胞,4℃溫育1 h,然后用4℃PBS洗4次(每次5 min)。
 
5.  稀釋的笫二抗體于4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min。
 
6.  加第二抗體于細胞上,4℃溫育4 h。然后用4℃PBS洗4次。
 
7.  若不想立即觀察細胞,則將細胞于PBS中存放。蓋好培養(yǎng)皿,以鋁箔包裹,冷藏,在24 h 內(nèi)觀察此實驗結(jié)果是很重要的,因熒光會迅速減弱或與細胞解離。


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