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噬菌體克隆純化實(shí)驗(yàn)步驟

閱讀：1024發(fā)布時(shí)間：2016-7-26

噬菌體克隆純化實(shí)驗(yàn)步驟
1.  在直徑82 mm LB平極上倒入含200 μl 宿主菌的3 ml 0.7%頂層瓊脂糖，放置10 min。

 

2.  通過(guò)放射自顯影膠片上的雜交斑點(diǎn)確定陽(yáng)性噬斑在原平板上的位置，用牙簽輕輕插入斑中。

 

3.  然后接種到步驟1制備的次級(jí)平板的頂層瓊脂糖中，此牙簽在平板上接連插30~40下。

 

4.  或用吸管插入陽(yáng)性噬斑的位置，取一小塊環(huán)形瓊脂糖轉(zhuǎn)入1 ml SM中。

 

5.  加入1滴，放置1~2 h，滴定，制備3~6個(gè)平板，每個(gè)平板的噬斑數(shù)應(yīng)小于500個(gè)。

 

6.  次級(jí)平板置37℃過(guò)夜培養(yǎng)，將噬菌斑影印到硝酸纖維素濾膜上。

 

7.  再依次處理、雜交、洗膜和曝光，然后在次級(jí)平板上找出對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性噬菌斑。

 

9.  對(duì)每個(gè)克隆，將牙簽插入雜交信號(hào)zui強(qiáng)的噬菌斑中，并在1 ml SM中放置5 min。

 

10.  將1 μl 噬菌體貯存液。1 μl 和10 μl 1：100稀釋液鋪三級(jí)平板。

 

11.  按以上步驟篩選第三級(jí)平板上的噬斑。

 

12.  重復(fù)這一純化過(guò)程，直至獲得純的噬斑為止，并將純的噬菌體保存在SM中。
噬菌體克隆純化實(shí)驗(yàn)步驟


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