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技術(shù)文章

反相液相色譜

閱讀：315發(fā)布時間：2015-6-1

實驗材料    蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒    膠母液磷酸氫氧化鈉三氯乙酸磺基水楊酸冰醋酸考馬斯亮藍(lán)
儀器、耗材    高壓電泳儀IEF槽離心機(jī)
實驗步驟    
一、樣品提取

1.  1 ml 原核表達(dá)細(xì)胞液離心取沉淀。

2.  沉淀用100 μl IEF樣品緩沖液裂解，離心取上清。

二、制膠

1.  安裝超薄膠裝置

2.  依次加入下述試劑

（1）膠母液  2 ml

（2）尿素  8 M/脫氣

（3）NP-40  0.2 ml

（4）兩性電解質(zhì)  2 ml

（5）10%過硫酸胺  50 ul

（6）TEMED  5 ul

3.  倒膠

三、電泳

1.  預(yù)電泳膠凝固后，拆卸制膠裝置，將膠連同支持膜一起置于水平電泳槽上（要求：電泳槽面板上首先被液體石蠟浸潤，在凝膠支持膜與電泳槽面板間無氣泡）。
 
2.  將分別被陰陽極緩沖液浸潤的電極條置于膠面上將與陰陽電極接觸的部位 ，蓋上電泳槽罩子，連通電源，200 V 預(yù)電泳10 min。

3.  電泳，將薄棉紙剪成小塊，輕輕置于預(yù)備點樣的膠面上，取10~15 ul 樣品液，點于薄棉紙上，蓋上罩子，連通電源進(jìn)行電泳

4.  電泳參數(shù)：200 V，30 min；400 V，30 min；800 V，4 hr。

四、染色

1.  固定，將電泳完的膠連同支持膜放置于固定液中，10 min。

2.  顯色，50℃下，將膠與支持膜放置于染色液中，顯色，直至條帶出現(xiàn)。


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