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信帆生物提供甲基化分析服務(wù)
DNA甲基化研究是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容,真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶,即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá),去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾的方式在脊椎動物的胚胎發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用,參與多種疾病包括各種腫瘤的發(fā)病機(jī)理,是目前表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。
主要技術(shù)原理
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而發(fā)生甲基化的胞嘧啶不變。根據(jù)某一待測位點(diǎn)或者調(diào)查的某一區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過PCR電泳、測序、熒光定量及質(zhì)譜等方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,根據(jù)檢測結(jié)果分析哪些位點(diǎn)發(fā)生了甲基化及其甲基化的頻率。
主要服務(wù)方案
1、甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變。設(shè)計(jì)針對某一待測位點(diǎn)的甲基化和非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物判定待測樣本是否存在甲基化位點(diǎn)。
2、亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變。針對要調(diào)查的區(qū)域設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷哪些CpG位點(diǎn)發(fā)生了甲基化;一般將PCR產(chǎn)物克隆后進(jìn)行測序成功率會比較高。
信帆生物提供甲基化分析服務(wù)
實(shí)驗(yàn)流程:
(1)BSP引物設(shè)計(jì):針對感興趣的基因區(qū)域進(jìn)行BSP引物的設(shè)計(jì)(擴(kuò)增產(chǎn)物不超過400bp)
(2)亞硫酸氫鹽處理基因組DNA:提取基因組DNA并進(jìn)行亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化
(3)PCR擴(kuò)增目的片段:BSP引物擴(kuò)增感興趣的區(qū)域
(4)克隆到載體:將PCR產(chǎn)物純化后連接到載體上
(5)克隆測序:挑取陽性菌斑,提取質(zhì)粒并測序(通常測序5個或10個克隆)
(6)序列分析:對測序的結(jié)果進(jìn)行比對和甲基化分析
信帆生物提供甲基化分析服務(wù)
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