流式細(xì)胞術(shù)在免疫研究中的多功能特點(diǎn)
單激光光源 儀器安裝一個(gè)激光器，一般以氬離子型為主有效光譜為488nm和515nm，適用激發(fā)異硫氰酸熒光素（FITC）；亦可激發(fā)異硫氰酸四甲基洛他明（Tetramethylrho-damine isothiocynate，TROTC）但效果不甚理想。合適的光源應(yīng)是氪離子激光，它的激發(fā)光譜531nm和856nm，也適用于Rhodamine 類衍生物XRITC。細(xì)胞用一種熒光染料標(biāo)記的抗體染色，稱為單標(biāo)記染色；亦可用雙標(biāo)記染色，即用兩種不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料分別標(biāo)記兩種抗體，同時(shí)針對(duì)一群細(xì)胞表面的兩種抗原進(jìn)行測(cè)定。三標(biāo)記染色是3種染料標(biāo)記3種抗體同時(shí)對(duì)細(xì)胞著染，即FITC和藻紅蛋白（Phyco-erithrin，PE）標(biāo)記抗體同F(xiàn)luorescent tandem結(jié)合物公用（R-phycoerythrin，加Texas red做為一種Duo CHROME）。近年新發(fā)展一種非熒光標(biāo)記法：免疫膠體金標(biāo)記，它可以補(bǔ)充熒光染料因光譜互相重疊而使檢測(cè)范圍受限的不足。方法是利用膠體金顆粒直接標(biāo)記抗體，細(xì)胞染色后用623nm波長(zhǎng)激發(fā)，90℃散射光提供信號(hào)。金標(biāo)記的細(xì)胞活性不受影響，可分選并用于增殖性實(shí)驗(yàn)。
雙激光光源 應(yīng)用雙激光光源的儀器擴(kuò)大了其分辨的標(biāo)記信號(hào)范圍和種類。根據(jù)光的波長(zhǎng)有兩種配合方式：一是紫外光和可見光波長(zhǎng)配合，兩個(gè)激光器分別發(fā)射可見光及紫外光其zui大特點(diǎn)是同時(shí)做細(xì)胞DNA含量和細(xì)胞表面標(biāo)記的測(cè)定，研究活細(xì)胞周期活動(dòng)中的免疫現(xiàn)象。同時(shí)，還可用Hoechat 33342在一定濃度下穿透細(xì)胞膜速率不同的特點(diǎn)，區(qū)別不同細(xì)胞類型，鑒別不同分化階段的細(xì)胞等。另一種是染料激光光源配合，是在較大功率的激光束中加一熒光染料器，使它發(fā)出特殊染料需要的激發(fā)光波長(zhǎng)，以增加測(cè)定范圍，近年由于染料的發(fā)展，已很少用此技術(shù)。
熒光偏振技術(shù) 是在儀器上裝備特殊的偏振光濾片，發(fā)出的偏振激光對(duì)大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的改變異常敏感。它可測(cè)定伴隨細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的早期免疫及生化改變。如膜的流動(dòng)性、細(xì)胞骨架成分、DNA構(gòu)象的變化等，可以提供敏感的早期有價(jià)值的信息。
分選（Sorting）和自動(dòng)克隆技術(shù) 目前通用的流式細(xì)胞計(jì)zui大的優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行分選和細(xì)胞克隆化。其原理是在樣品噴射成液流、一系列液滴形成的過程中，這些液滴帶上電荷，細(xì)胞被包在一個(gè)帶電的液滴內(nèi)。在強(qiáng)大的電場(chǎng)作用下，從主流束中偏向一側(cè)，通過帶電的水滴及電場(chǎng)控制，把偏離的液滴收集于試管內(nèi)、玻片上或定量收集于96孔培養(yǎng)板上，后者即為自動(dòng)克隆化技術(shù)。這一切都可根據(jù)研究人員的需要，在儀器的顯示屏上確定要分選的細(xì)胞群體。每次可分選兩群細(xì)胞，隨著技術(shù)的進(jìn)步，分選量也越來越大。
會(huì)員1.png)