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DNA重組技術(shù)的基本過程

閱讀:190發(fā)布時間:2016-3-28

蛋白質(zhì)工程介紹:

   基因的核苷菌順序決定了蛋白質(zhì)中氨基酸的排列次序。在DNA重組技術(shù)等的基礎(chǔ)上,通過核苷酸缺失、插入、移位和替換等方式使基因突變,來構(gòu)建人們期待的新基因,從而產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)(酶)已經(jīng)為可能。此稱為蛋白質(zhì)工程。

例如,一個蛋白質(zhì)中特定的氨酸要突變成肽氨酸,只要制備得到這個蛋白質(zhì)的基因或是cDNA基因,又知道要突變的部位及其鄰近的堿基順序,就能實現(xiàn)這種突變。已知*是由TCT編碼若把C突變成G,就變成半肽氨酸的密碼TGT。為此,用人工合成一段寡聚核苷酸引物,引物里除含有TGT外,其余核苷酸均與基因部分互補。打開含有被突變蛋白質(zhì)基因的雙條鏈,用引物與之互補鏈退火(加入退火在適宜溫度下進行,約15個堿基中,有一個堿基錯配是可以容忍的)。由DNA聚合酶延伸、克隆所得鏈轉(zhuǎn)入宿主細胞復(fù)制,即產(chǎn)生兩種子代DNA。一種順序中含有TCT順序,另一種含有TGT順序。表達具有TGT順序的DNA,既可以產(chǎn)生在*部位上半肽氨酸代替*的蛋白質(zhì),原則上應(yīng)用這種寡聚核苷酸誘導(dǎo)突變的方法可以生產(chǎn)任何特定的蛋白質(zhì)(酶)。

據(jù)1991年至1992年“Science”統(tǒng)計,在全文報道的13個蛋白質(zhì)晶體中,有9個是基因克隆表達的蛋白,占總數(shù)的69%。這一情況表明:基因表達和定點突變等技術(shù)有機地結(jié)合將產(chǎn)生更多的新功能蛋白質(zhì)。應(yīng)用定點突變還可以了解蛋白質(zhì)是如何折疊、如何識別其他分子以及如何催化反應(yīng)和如何加工等結(jié)構(gòu)與功能。

由于DNA的核苷酸順序比蛋白質(zhì)的氨基酸順序易測定,所以可以通過測定基因的核苷酸順序,來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序,并預(yù)測可能的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是生物功能的基礎(chǔ)。過去測定蛋白質(zhì)順序是十分困難的,乳S.Sanger用了十年的時間,于1953年才報道了胰島素的全部氨基酸排列順序。根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)統(tǒng)計,自1959年測定肌紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)以來,到1988年以前的30年間,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定總數(shù)大約是300個。幾乎是10年一個。直到DNA重組技術(shù)等新技術(shù)出現(xiàn)后的1988年,結(jié)構(gòu)的預(yù)定速度增長到100個/年;隨后以驚人的速度發(fā)展,到1990年接近1個/d,1995年達到3.5/d。所以,生命科學(xué)自20世紀(jì)90年代以來,迎來了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的時代。所謂結(jié)構(gòu)生物學(xué)即是以生命物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及其運動為基礎(chǔ),來闡明生命活動和生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)。

應(yīng)該說,DNA重組技術(shù)、PCR、定點突變等技術(shù)已在核酸和蛋白質(zhì)兩大分子物質(zhì)研究之中架起了一座橋梁。生物化學(xué)家,現(xiàn)在可以在基因和蛋白質(zhì)兩個研究領(lǐng)域之間“自由走來走去”。從基因和cDNA的分析中,可以發(fā)現(xiàn)以前不知道的蛋白質(zhì)的存在,并將它們分離和純化出來。相反,純化一種蛋白質(zhì)可以找到它的基因或cDNA基因。因為現(xiàn)在有了微量化學(xué)技術(shù)和基因克隆擴增技術(shù)(包括PCR技術(shù)),只要有微量的蛋白質(zhì)和核酸就足夠了。

第四節(jié)、體細胞克隆技術(shù)

  1997年“Nature”雜志報道,英國學(xué)者I.Wilmut等人從一只胚胎羊中取出乳腺上皮細胞進行培養(yǎng)(供體),再用另一母羊的卵母細胞(受體)摘出細胞核后,與上述乳腺上皮細胞進行體外融合。融合體經(jīng)培養(yǎng)后,植入受體母羊的子宮中,結(jié)果發(fā)育并分娩出一頭小羊“多利”。由于這頭小羊不是由受精卵發(fā)育而成的,而是由體細胞核(乳腺細胞)在卵細胞中無性繁殖而成,所以稱為“克隆羊”。形成的個體具有供體所具有的特征。

     這是20世紀(jì)90年代生物科學(xué)震驚世界的成就。它表明成熟的體細胞可以不經(jīng)過有性繁殖而發(fā)育成個體,這在過去是認為不可能的。其潛在的誘惑力在于既然可以克隆羊,是否也可以克隆其他動物,以至人自身。其前景不僅在生物學(xué)界,也在社會學(xué)、人類學(xué)、倫理學(xué)界引起了廣泛的重視和爭論。自那以后,世界范圍內(nèi)先后成功地克隆出了牛、馬、猴、狗等動物。有的克隆動物,如牛還有了后代。然而,這項技術(shù)還有待成熟(多利三年后死亡),許多克隆動物的生長發(fā)育及特性還有待研究、重復(fù)驗證。但這項技術(shù)在生物學(xué)上的確是了不起的事件,如果將這項技術(shù)用于挽救一些瀕臨滅絕的物種等方面,其價值將是不可估量的。


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