6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）試劑盒說明書
分光光度法 50 管/48 樣
測定意義：
G6PDH（EC 1.1.1.49）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，催化 6-磷酸葡萄糖氧化為 6 -磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時將 NADP+還原為 NADPH，供生物合成及維持細胞內(nèi)的還原狀態(tài)用。因此 6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性的高低可以從一定程度上反映出生物體的生物合成和抗氧化能力。
測定原理：
G6PDH 催化 NADP+還原生成 NADPH，在 340 nm 下測定 NADPH 增加速率。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；試劑一：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；用時每支加 550μL 蒸餾水充分溶解備用；試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；用時每只加 550μL 蒸餾水充分溶解備用。
樣本的前處理：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將試劑一置于 37℃(哺乳動物)或 25℃（其它物種）水浴中預熱 10min 左右。3、操作表：
試劑名稱（μL） | 測定管 |
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試劑一 | 750 |
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試劑二 | 10 |
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試劑三 | 10 |
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樣本 | 30 |
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將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，加樣本的同時開始計時；混勻，在 34 0 nm 波長下記錄 1min 時的初始吸光度 A1 和 6min 時的吸光度 A2，計算ΔA=A2-A1。
注意事項：若ΔA 大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋，計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)?；?qū)⒎磻獣r間縮短至 2min，使 A2-A1 小于 0.5，可提高檢測靈敏度。
G6PDH 活力單位的計算：
1、血清（漿）G6PDH 活力的計算:
單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。
G6PDH（U/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=857×ΔA
2、組織、細菌或細胞中 G6PDH 活力的計算:（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
G6PDH（U/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=857×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
G6PDH（U/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=857×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
G6PDH（U/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.715×ΔA V 反總：反應體系總體積，8×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：
比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。
