ELISA吸附技術(shù)是一種已確立的植物病毒檢測(cè)方法,尤其適用于大量材料的檢測(cè)。然而,該檢測(cè)技術(shù)中所便用的一次性的聚苯乙烯微量反應(yīng)板的花費(fèi)卻是很大的。不少研究者曾嘗試用各種方法去清洗反應(yīng)板,以便能再使用。
進(jìn)行雜合反應(yīng)時(shí)所使用的探針若為放射性物質(zhì)所標(biāo)定者，雜合訊息可經(jīng)由放射顯影術(shù)偵測(cè)出來；若為DIG所標(biāo)定者，則需借助anti-DIG抗體與堿性去磷酸酶的conjugate，并利用堿性去磷酸酶的酵素活性轉(zhuǎn)現(xiàn)雜合反應(yīng)訊息。目前常用來進(jìn)行堿性去磷酸酶呈色反應(yīng)的基質(zhì)為NBT(nitroblue tetrazolium) 與BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,toluidinium salt)； 此外，也可以選用CSPD或CDP-Star等試劑，以增加檢測(cè)敏感度。
其詳細(xì)操作步驟及注意事項(xiàng)如下：
◆注意：
a.以下反應(yīng)條件與程序主要是參照DIG nucleic acid detection kit 制造廠商所提供的產(chǎn)品說明書。
b.北方與南方雜合的尼龍膜可同步處理，所有反應(yīng)于室溫進(jìn)行。
c.以平端鑷子將尼龍膜自一種溶液移至次一種溶液時(shí)，盡可能滴干前者的殘留部份，以免影響后續(xù)反應(yīng)。
d.浸洗過程應(yīng)以搖蕩器低速搖動(dòng) (50 rpm)，以便加強(qiáng)作用。
1)進(jìn)行anti-DIG/AP conjugate 與DIG-核酸探針的免疫結(jié)合反應(yīng)：
a)以50 mL 的washing buffer 浸洗尼龍膜1 min。
b)Blocking：把尼龍膜放入20 mL blocking solution 作用30 min，以便填充尼龍膜上的非專一性結(jié)合部位。
c)取出2 μL 的anti-DIG-AP conjugate，并以10 mL 的blocking solution 稀釋。
d)免疫結(jié)合反應(yīng)：把anti-DIG-AP conjugate 稀釋液連同尼龍膜一起放入塑料袋內(nèi)，仔細(xì)除去氣泡并封口的后，低速搖動(dòng)作用30 min。
e)以50 mL washing buffer 浸洗尼龍膜2 次 (每次15 min)，以便去除多余及非專一性結(jié)合于尼龍膜的anti-DIG-AP conjugate。
f)將尼龍膜放置于20 mL 的detection buffer 漂洗2 min。
2)堿性去磷酸酶呈色反應(yīng)：
a)取出尼龍膜，放入10 mL 現(xiàn)配的color-substrate solution，并隨即把尼龍膜及作用溶液移至黑暗環(huán)境 (例如抽屜內(nèi)) 作用。每幾分鐘檢視一次，待紫色條帶出現(xiàn)時(shí)即可終止反應(yīng)。
b)欲終止反應(yīng)時(shí)，請(qǐng)把尼龍膜移至50 mL TE 浸漬5 min。
c)拿出尼龍膜，滴干反應(yīng)液后放置于衛(wèi)生紙上風(fēng)干至少30 min，加以護(hù)貝即可保存。
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