在ELISA試劑盒中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的挑選是很主要的，其間包含:辦法一 用于檢查不知道抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反響孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗刷緩沖液洗3次，每次3分鐘。
2. 加樣：加必定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反響孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗刷。(一起做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3. 加酶標(biāo)抗體：于各反響孔中，參加新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗刷。
4. 加底物液顯色：于各反響孔中參加暫時(shí)制造的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5. 終止反響：于各反響孔中參加2M硫酸0.05ml。
6. 成果判定：可于白色布景上，直接用肉眼調(diào)查成果：反響孔內(nèi)色彩越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反響為無色或極淺，根據(jù)所呈色彩的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測OD值：在ELISA試劑盒檢查儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)則的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
辦法二 用于檢查不知道： 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗刷3次。
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加必定稀釋的待檢樣品(不知道抗體)0.1ml于上述已包被的反響孔
中,置37℃孵育1小時(shí),洗刷。(一起做空白、陰性及陽性孔對照)
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于反響孔中，參加新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，
37℃孵育30-60分鐘，洗刷,zui終一遍用DDW洗刷。
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ELISA試劑盒其他過程同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
(1)固相載體的挑選：很多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。現(xiàn)在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體，在運(yùn)用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反響，調(diào)查其顯色反響是不是均一性，據(jù)此判明其吸附功能是不是杰出。
（2)包被抗體(或抗原)的挑選：將抗體(或抗原)吸附在固相載體外表時(shí)，請求純度要好,吸附時(shí)一般請求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)刻及其蛋白量也有必定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不一樣的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進(jìn)行包被后，在其它實(shí)驗(yàn)條件相一起，調(diào)查陽性標(biāo)本的OD值。挑選OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。關(guān)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說一般為1～10μg／ml。
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