丙酮酸激酶(PK)測(cè)試盒_糖酵解系列_分光法
測(cè)定方法：分光光度法
產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣
注 意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
PK（EC 2.7.1.40）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化糖酵解過程中的后一步反應(yīng)，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一，因此測(cè)定PK活性具有重要意義。
丙酮酸激酶(PK)測(cè)試盒_糖酵解系列_分光法
測(cè)定原理：
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反映PK活性。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存;
試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存；；
試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；
試劑三：液體25μL×2支，4℃保存；
樣本的前處理：
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）試劑二的配制：臨用前取試劑二一瓶，加入22.5mL試劑一和2.65mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用。
（2）試劑三的配制：臨用前取試劑三一支，加入1.5mL蒸餾水充分溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用。
（3）在1mL石英比色皿中加入50μL樣本、50μL試劑三和900μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和 2min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
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