做料研實驗需要耐心和細心,一個不小心,實驗結(jié)果就會出現(xiàn)很大的偏差， 上周有朋友們向我們咨詢暴浮細胞培養(yǎng)的正確方法，上海紀(jì)寧生物技術(shù)員為大家整理了懸浮細胞培養(yǎng)的步驟, 一起來學(xué)習(xí)下吧。

一.材料與儀器

1.凍存HeLa S3細胞

70%乙醇MEM-10/ EDTA

旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)基5 25 cm2組織培養(yǎng)瓶C02培養(yǎng)箱Sorvall H-6000A轉(zhuǎn)子100 ml或200 ml通氣旋轉(zhuǎn)瓶和帶濾膜的瓶蓋.

二、步驟

1.將含有凍存HeLa S3細胞的安瓿放入379C水浴中解凍。

2.用70%乙醇對安瓿的頂端進行消毒,打開安瓿,用吸管將細胞轉(zhuǎn)移到含有5 ml MEM-10 培養(yǎng)基的25 cm2組織培養(yǎng)瓶中,輕輕搖動培養(yǎng)瓶,使細胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中,放入5% CO2加濕培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)過夜。

3.將培養(yǎng)基吸出,用0.5 ml 37%C的/EDTA覆蓋細胞,消化30~40 s。

4.加入10 ml旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)基.5 ,并將細胞轉(zhuǎn)移至50 ml的離心管中。室溫1800g離心5min,棄上清。

5.將細胞沉淀懸浮在5 ml的旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)基5中，上下吹打,將細胞團打散。

6.在100 ml或200 ml通氣旋轉(zhuǎn)瓶中加入50 ml旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)基-5 ,并將細胞懸液轉(zhuǎn)移到瓶中。

7.取出1 ml細胞懸液,用血細胞計數(shù)器(附錄3F)進行細胞計數(shù)。加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)基5 ,使細胞密度為(3~4) x 105細胞/ml。將細胞放入無CO2培養(yǎng)箱, 37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。

8.隨后的兩天讓細胞繼續(xù)生長,并且每天對細胞進行計數(shù),加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)基-5以維持( 3~4) x105細胞/ml的細胞密度。

9.取1 ml的細胞懸液,用血細胞計數(shù)器對細胞進行監(jiān)測。

10.當(dāng)細胞密度達到(4~5) x105細胞/ml時,隔天或每天用培養(yǎng)基將細胞稀釋至1.5x105或2.5x105細胞/ml.

11.分別將裝有50 ml或100 ml細胞懸液的100 ml或200 ml通氣旋轉(zhuǎn)瓶放入37°C無CO2培養(yǎng)箱旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。每天或隔天傳代。

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以上是淺談懸浮細胞培養(yǎng)的正確方法，你知道了嗎？