一、實驗目的

1、了解抗血清制備的基本過程：

2、掌握抗血清的收集和保存方法。

二、實驗原理

    抗血清為含有某一類具有特異免疫功能的抗體分子的血清，一般為動物被人工注射某類抗原后制備的動物血清。價的抗血清用于研究工作以及疾病的診斷和治療。

    一種抗原能否引起抗體生成反應，一方面取決于抗原分子表面有無抗原決定簇（antigenic determinant），另一方面取決于機體的免疫狀態(tài)，當具備以上兩個條件后，抗體生成將遵循抗體生成的一般規(guī)律——初次反應和再次反應。

    抗原的種類繁多，包括天然的蛋白質(zhì)抗原和細胞性抗原、合成性抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫動物具有不同的特殊性。一般*抗原免疫動物需加用佐劑，尤其在使用可溶性抗原時，以期得到價的抗血清；合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物質(zhì)需先通過人工的方法與蛋白質(zhì)載體連接后再與佐劑混合免疫動物，方可獲得理想的免疫效果。使用佐劑后可增加抗原的免疫原性和延長抗原在機體內(nèi)存留的時間，從而改變了抗原原有的免疫原性。

三、實驗材料：

1、金屬編號牌（對動物作標記錄）或染料；

2、1毫升，5毫升、20毫升注射器；

3、*頭（9#，12#），卡價苗針頭（41/2 # — 51/2 #）；

4、滅菌平皿，疫苗瓶，*瓶，皮塞以及吸管，脫脂棉；

5、卡介苗（75mg/ml）；

6、抗原（小鼠血清）；

7、*溶液，*溶液和5%葡萄糖溶液；

8、液體石臘（醫(yī)用），羊毛臘（配制佐劑用）；

9、滅菌生理鹽水，消毒用酒精，2.5%碘酒；

10、1.5%瓊脂，玻板，飯盒（保濕、保濕作用）；

11、實驗動物（家兔）。

四、實驗步驟

1、動物的選擇

    羊、馬、雞、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫動物，在實驗中，選擇動物時應考慮抗原與動物的種屬關系、抗原性質(zhì)與動物種類、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及動物個體等因素。免疫用動物應選適齡、健壯．為雄性。zui常用的實驗動物是家兔，一般選擇選擇年齡在6個月以上當年繁殖的♂性，體重2 ～3公斤，健康家兔三只，免疫前用金屬編號牌固定兔耳，或用染料涂沫在動物的背部，作出明確的標記。

2、抗原制備

    1）抗原稀釋：用滅菌生理鹽水將抗原稀釋為2mg/ml，于免疫前一天加入*溶液，使每毫升抗原溶液含*1000 UI，*1000 UI，放4℃隔夜（一般可不加青、*）次日取出，與佐劑混合制成乳劑后用于動物免疫。

    免疫原的注射劑量應考慮其抗原性的強弱、分子量大小、動物的個體狀態(tài)和免疫時間。對于純的可溶性抗原的免疫劑量，通常小鼠抗原劑量為50～100μg/次，大鼠為100～200μg/次，兔為100μg ～1 mg/次，合成免疫原為2 mg(半抗原約為20～200μg)，一般需要與等量的福氏*佐劑混合。加強免疫的劑量為計量的1/2，通常用不*福氏佐劑或不用佐劑。如需制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫法；反之，欲獲得價的抗血清，宜采用大劑量抗原長程免疫法。

    2）佐劑和抗原乳劑的配制

    1、佐劑的配制：福氏*佐劑（Freund’s complete adjuvant），各實驗室的配方不盡相同，我室采用的配方如下：

    醫(yī)用液體石臘 20毫升

    羊毛脂 12克

    水浴溶化、混勻，分裝于*小瓶，用紗布、線繩扎緊瓶塞。8磅20分鐘滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ诿庖咔皽蕚淇乖閯┲苽鋾r，以活卡介苗（有時亦用死卡介苗）代替死結(jié)核菌，每毫升試劑中加入10mg活卡，即為福氏*佐劑。

    2、抗原乳劑的制備：其方法一般有兩種，其一，將等量的*佐劑（注意佐劑必須預先加熱融化，但不超過50℃）和抗原溶液分別吸入兩個5ml注射器內(nèi)，在兩個注射器的12# 針頭間套上一根長約8～12cm的醫(yī)用無毒塑料管，將兩個注射器連接在一起（塑料管必須先經(jīng)酒精浸泡消毒，使用時取出，用滅菌生理鹽水沖洗后，與注射器針頭相連接，塑料管與針頭的口徑須合適，不能松，稍緊些為宜），針頭插進塑料管約1～2cm然后由兩人相對而坐后緩緩推動針蕊，使管內(nèi)溶液進入塑料管道至對側(cè)注射器內(nèi)，每次推動針蕊時必須把管內(nèi)容物全部推出，另一側(cè)也同樣操作，使管內(nèi)液體往返混合，直至形成油包水乳劑（Water-in-oil enulsion）為止。

    其二是，將等量的佐劑和抗原溶液倒入缽內(nèi)，經(jīng)過反復碾磨，也可形成油包水乳劑，該法主要優(yōu)點是快速，可靠，不足方面主要是由于粘附過多，浪費佐劑及抗原。

    制成的乳劑是否形成油包水乳劑直接影響免疫效果，因此，必須進行質(zhì)量檢查，檢查的方法是將制成的乳劑滴一滴在涼水（自來水）表面，質(zhì)量合格的乳劑滴入水面保持滴珠完整而不分散，不合格者進入水面后立即擴散，水面油亦逐漸擴大，這就必須要繼續(xù)操作至質(zhì)量合格為止。但有時，由于佐劑的配制質(zhì)量原因，很難乳化至合格，遇有這種情況，須考慮重新配制佐劑。

    3、免疫途徑，劑量和免疫周期

    抗原注射途徑可根據(jù)不同抗原及試驗要求，選用皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈或淋巴結(jié)內(nèi)等不同途徑注入抗原進行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴結(jié)周圍、耳后等處皮內(nèi)或皮下多點注射。初次免疫與第二次免疫的間隔時間多為2～4周。常規(guī)免疫方案為抗原加CFA皮下多點注射進行基礎免疫；再以免疫原加IFA作2～5次加強免疫，每次間隔2～3周，皮下或腹腔注射加強免疫。

    1）常規(guī)（皮內(nèi)多點注射）免疫：

    1*次免疫：劑量為每只兔子注射1.0 ml抗原乳劑（含抗原量1～2mg）。注射部位為兩只后腳掌的皮內(nèi)各注射0.2 ml，其余0.6 ml分多點注入脊柱二側(cè)，頸部，腹股溝和腋窩等處淋巴結(jié)附近部位皮內(nèi)，每點可注入0.05ml，分12點注入。

    2第二次免疫：初次免疫后20天左右，劑量為1.0ml/只（1～2 mg/ml），加福氏不*佐劑。注射部位在腹部皮下多點注射，每點注入0.1 ml。

    3第三次免疫：再次免疫后兩周內(nèi)進行，注射劑量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d抽取少許靜脈血，分離血清，試血測定效價。

    2）淋巴結(jié)免疫：主要優(yōu)點是可減少抗原用量。過程如下：

    1卡價苗致敏：免疫前足掌皮下每側(cè)各注入活卡價苗（75 mg/ml）0.3 ml。10天左右觀察兩側(cè)腘窩淋巴結(jié)，一般可腫脹如蠶豆大小，此時即可進行淋巴結(jié)內(nèi)免疫注射。

    2*次免疫：用手淋巴結(jié)后在兩側(cè)腘窩淋巴結(jié)內(nèi)各注入抗原乳劑0.25ml，每只兔總量0.5 ml；為加強免疫，于初次免疫20天后，于腹部皮下多點注射不加佐劑抗原溶液1mg/1ml。

    3二周后可如同*次免疫的劑量和途徑再注射一次，一般可在第三次免疫注射前試血滴定效價，效價如已達到要求可不必進行第三次免疫。有條件的情況下，免疫后要加強動物飼料管理，如給熟黃豆飼養(yǎng)等。

    3）腹腔免疫：一般不必加佐劑，適用于細胞性或顆粒性抗原，而且抗原性較強者，例如用綿羊紅細胞免疫家兔或小鼠即可用此法。