本分析方法是一種簡(jiǎn)單、快速和極為靈敏的用于檢測(cè)粗制提取物中序列特異性的DNA結(jié)合蛋白的方法。在電泳時(shí)，與末端標(biāo)記的DNA段特異結(jié)合的蛋白質(zhì)阻滯了片段的遷移，因而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于蛋白-DNA復(fù)合物的清晰電泳條帶。

實(shí)驗(yàn)材料    質(zhì)粒DNA
試劑、試劑盒    dNTPDNA聚合酶Klenow酶TETAE溴化乙錠TEMED過(guò)硫酸銨BSA
儀器、耗材    培養(yǎng)箱離心管
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  用一種或多種限制性內(nèi)切酶在100 μl 體積中消化10 μg 質(zhì)粒人，產(chǎn)生25~100 bp  的含有結(jié)合位點(diǎn)的DNA段，并至少有一端是5’突出的。

2.  加100 μCi［α-32P］dNTP，4μl 5 mmol/l 3種NTP的混合液，2.5U Klenow酶。室溫溫育20 min。
 
3.  加4 μl 含有5 mmol/l 與被標(biāo)記的相同的dNTP溶液，室溫溫育5 min。

4.  沉淀DNA，溶解于TE中。
 
5.  加10×加樣緩沖液，用2%小型瓊脂凝膠（含溴化乙錠5 μg/ml）在TAE或TBE緩沖液中進(jìn)行電泳。
 
6.  在長(zhǎng)波透射紫外燈下觀察電泳帶。在帶的下游切一平行縫隙，插入一片DEAE膜（先在凝膠緩沖液中浸濕）。將膜緊擠于膠中，繼續(xù)電泳直到泳動(dòng)至膜上。

7.  將膜在電泳緩沖液中洗一下，在濾紙上吸干。將膜放入1.5 ml 螺口蓋的圓底管底部，其中裝有400 μl DEAE洗脫液，68℃水浴30 min。

8.  將洗脫液移入1.5 ml 的離心管中，4℃微量離心15 min。將上清轉(zhuǎn)入干凈管中，留10 μl 于原管管底。
 
9.  在上清中加入4 μl 1 mol/l MgCl2。用1 ml 100%乙醇沉淀DNA，重懸于100 μl TE緩沖液中。
 
10.  取1 μl 測(cè)定cpm/μl min，用溴化乙錠打點(diǎn)法定量估計(jì)DNA濃度。
 
11.  安裝16 cm 長(zhǎng)的電泳玻璃板和1. 5 mm 厚的墊片。在40 ml 低離子強(qiáng)度凝膠混合液中加100 μl 30%的過(guò)硫酸銨及34 μl TDMED，灌入玻璃板之間，插入齒寬≥7 mm 的梳子。讓膠聚合20 min。

12.  將梳子和底邊的墊片取出。將膠放入盛有低離子強(qiáng)度電泳緩沖液的電泳漕中，用雙頭泵以5~30 ml/min 循環(huán)電泳緩沖液。100 V（約22mA）預(yù)電泳90 min以上， 

13.  在微量離心管中，加終體積15 μl 的下列成分：10 000 c/min 的DNA探針，終濃度300 μg/ml BSA，及取自緩沖液中的粗制蛋白提取物中的大約15 μg 蛋白質(zhì)。混勻，置30℃水浴15 min。
 
14.  在1個(gè)加樣孔加入少量10×加樣緩沖液并讓染料跑進(jìn)膠。在其他孔中加各結(jié)合反應(yīng)液，在約30~35mA下電泳，直至溴酚藍(lán)（相當(dāng)于約70 bp 的條帶）達(dá)到膠底。
 
15.  卸下凝膠電泳裝置，撬開(kāi)電泳玻璃板，將粘附了凝膠的玻璃板平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在膠上放置3張Whatman 3MM濾紙。將濾紙連同凝膠一起揭下。

16.  用塑料薄膜包裹凝膠進(jìn)行真空干燥。在不使用增感屏的條件下，凝膠膜放射自顯影，或用增慼屏放射自顯影2~3 h。