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酶標儀的標準配置包括405nm,450nm及630nm三塊濾光片,具有紫外功能的酶標儀還配備有340nm.
目前用于酶聯(lián)免疫吸附測定,zui常使用的標記用酶是辣根過氧化物酶(HRP),對應(yīng)的底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)。底物在*的存在下,經(jīng)辣根過氧化物酶作用,分別氧化為2,2,—二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。
鄰苯二胺(OPD)的氧化產(chǎn)物DAB, 在pH值為5.0左右時,在450nm波長處有zui大吸收,此時可用450nm的濾光片測定吸光值。當加入強酸作為終止試劑終止反應(yīng)時,pH值降到接近0,此時zui大吸收波長移至492 nm,此時可用492nm的濾光片測定吸光值。
四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌,一般在波長為450nm處有zui大消光系數(shù)。使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min,便于檢測。
因此,450nm和492 nm兩個波長是目前ELISA測定zui常用的。有的酶標儀以490nm濾光片替代492nm濾光片,影響不大。
除了這兩個基本濾光片外,考慮到雙波長比色的需要,還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片,雙波長比色主要用于消除非特異干擾的影響。
如果實驗需要用酶標儀作微量生化測定,就需要擴展紫外檢測功能,此時需要一個340 nm波長濾光片。
總之,以上介紹的是常用的幾個波長的濾光片,用戶還可以根據(jù)自己的需求選擇其他波長的濾光片。一般各種酶標儀都配有放置濾光片的可自動轉(zhuǎn)換的部件,可以同時安裝6~8片濾光片,可以滿足用戶的不同需求。
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