方案優(yōu)勢

假定你抽提 rna 時使用到的有機試劑 - 氯仿、異丙醇、無水乙醇 - 都是國產(chǎn)的 (這是*可以使用的)。我的問題是：你采取了什么措施來降低或者杜絕 RNase 的污染?具體地：你是如何選擇、預處理、使用和保存氯仿和異丙醇? 你是如何配制和保存 75% 乙醇? 坦率地講，因為有機試劑的問題導致抽提失敗，我真沒有聽到;或許有的問題是由有機試劑導致，但使用人也多是不會懷疑到這一點的。恐怖分子的行為倒是聽到過：對氯仿、75% 乙醇進行高壓滅菌處理。令我無言的是，這樣的恐怖行為既沒有導致恐怖的后果，也沒有影響實驗的成功。不過我還是想提供一些建議。我關(guān)注的是質(zhì)量控制，而不是單單是簡單或者方便。 RNA 抽提中涉及的有機試劑，包括*、氯仿、異丙醇、乙醇。*多為商品化的東西了，選擇和保存都不應(yīng)該有什么問題;只強調(diào)一點：盡管 Tris 飽和的*也可以用于 RNA 的抽提，但使用水飽和*會更好一些，因為 RNA 在 pH 7 以上的溶液中，發(fā)生降解的機率大大提高。下面是關(guān)于氯仿、異丙醇、乙醇的有關(guān)建議。選擇國內(nèi)大的化學試劑公司生產(chǎn)或者監(jiān)制的分析純級別試劑就*可以滿足要求。預處理不需要進行任何的預處理。不可以高溫高壓滅菌：這不是該不該的問題，而是能與不能的問題。這三個試劑的沸點都低于 100C，高溫高壓可能導致危險。 75% 乙醇的配制一份無菌無酶的水與 3 份 (體積)無水乙醇混勻即成。不要使用量筒等過渡容器，使用天平來秤量：水的比重為 1，無水乙醇的比重按 0.785 計算。是先將無水乙醇倒出部分后再加入水，還是往裝水的瓶子中加入無水乙醇，沒有什么區(qū)別。事實上，70% - 80% 的乙醇都具有較好的洗滌能力，同時也不會導致片段比較大的核酸的丟失，所以，配制時就不要為了準確而左勾右兌的。關(guān)于現(xiàn)用現(xiàn)配，從質(zhì)量控制角度看，不是一個好的辦法;這也是你永遠發(fā)現(xiàn)不了75% 可能會有問題的基礎(chǔ)。75% 乙醇也不可以高溫高壓滅菌，原因同無水乙醇。保存首先，要使用新的試劑;試劑架上別人使用過并寫有標記的，一定要找當事人確定，以防已被用于其它用途而標記未改。其次，分成相對小一點的包裝 (50ml – 100ml);500ml 的瓶子取液是非常不方便的，移液器的桿子往往都進入了瓶口里，非常容易造成污染。第三，塑料瓶子密閉性好，裝醇類試劑是非常好的選擇;但氯仿不要使用塑料瓶子。第四，蓋緊瓶蓋，作好標記，再在瓶子上蓋上一個透明塑料袋防塵。第五，保存于室溫。將有機試劑保存于冰箱的人不在少數(shù)，但這么做卻是令人奇怪的。首先，任何揮發(fā)性的東西都不保存在冰箱 (除非萬不得已，如 DEPC)，這應(yīng)該成為一個良好的習慣。其次，與外面相比，冰箱除了灰塵少一點外，什么都會比外面多的。第三，在室溫打開低溫的瓶子，將導致空氣大量進入瓶子，增加了污染的風險。使用非常幸運的是，有機試劑對菌污染和酶污染似乎有我們想象不到的抑制和滅活作用，所以，使用這些試劑沒有特殊的要求，按正常抽提 RNA 的要求就*可以了。吸取有機試劑時，使用比要吸取的體積大的移液器，因為有機試劑有越吸越多的現(xiàn)象，試劑容易接觸到移液器的桿頭 – 污染不說，氯仿會腐蝕桿頭的。75% 乙醇使用一次性的吸管移取，一次可以吸數(shù) ml，既快又方便。如果舍不得丟棄，用完后放入塑料自封袋中保存，是非常安全的。