借助于噬菌體ELISA的DNA/RNA結(jié)合活性的分析方法

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 噬菌體的制備

   1) 挑取含有源自文庫(kù)篩選的噬菌體克隆的單菌落。用滅菌牙簽挑取單菌落接種于滅菌圓底培養(yǎng)板的微孔內(nèi)，其中加有150ul含15ug/ml的四環(huán)素的2×TY培養(yǎng)基。用一個(gè)微孔培養(yǎng)展示野生型DNA/RNA結(jié)合區(qū)域的噬菌體，作為陽性對(duì)照。以250r/min的速度小心振蕩微孔板，30℃培養(yǎng)16小時(shí)。

   2) 在合適的吊斗式離心機(jī)中3700g離心96孔培養(yǎng)板15分鐘，以制備噬菌體上清液。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微孔板內(nèi)，4℃保存。

2. 噬菌體ELISA

   1) 將生物素聯(lián)結(jié)的核酸靶標(biāo)位點(diǎn)(通常是0～5pmol之間，稀釋于50ul PBS緩沖液中)加入鏈親和素包被的微孔板內(nèi)。對(duì)于陽性對(duì)照，將適量的野生型結(jié)合位點(diǎn)加入一個(gè)微孔內(nèi)。用一個(gè)只含PBS緩沖液的微孔作為陰性對(duì)照，以測(cè)定ELISA的本底。將微孔板于20℃放置15分鐘。

   2) 每孔加入150ul含有4％(w/v)脫脂牛奶的PBS緩沖液作為封閉劑。將微孔板于20℃放置1小時(shí)。

   3) 將噬菌體上清液(得自步驟1.2)1:10稀釋于lml含有2％(w/v)脫脂牛奶、1％(體積分?jǐn)?shù))Tween-20及20ug/ml的超聲破碎的鮭魚精DNA的PBS緩沖液中。

   4) 將核酸包被的微孔中的封閉液棄去，加入50ul稀釋過的噬茵體上清液。將微孔板于20℃放置l小時(shí)。

   5) 將結(jié)合液棄去，用200ul含1％(體積分?jǐn)?shù))Tween-20的PBS緩沖液洗滌7次，再用PBS緩沖液?jiǎn)为?dú)洗滌3次。

   6) 將HRP聯(lián)結(jié)的抗M131gG抗體用含有2％(w/v)脫脂牛奶的PBS緩沖液作l:5000稀釋，然后每孔加入50u1。20℃放置l小時(shí)。

   7) 將抗體結(jié)合液棄去，用200ul含0.05％(體積分?jǐn)?shù))Tween-20的PBS緩沖液洗滌3次，再用PBS緩沖液?jiǎn)为?dú)洗滌3次。

   8) 加入100ul HRP底物液，如上文所述的基于TMB的顯色液，使ELISA顯色。約5分鐘后終止顯色反應(yīng)，如使用TMB，則加入100ul 1 mol/L的硫酸。立即用酶標(biāo)儀測(cè)定ELISA數(shù)值。

   9) 要評(píng)估篩選出的結(jié)合區(qū)域的特異性序列的結(jié)合性，將它們的ELISA數(shù)值與陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的數(shù)值進(jìn)行比較。