圖1. 雙抗體夾心法測(cè)抗原示意圖
 

本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。
 

這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類(lèi)的抗原測(cè)定。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定。HbSAg及HbS的測(cè)定。

血清血漿體液

碳酸鹽包被緩沖液抗體球蛋白吐溫檸檬酸硫酸

酶標(biāo)比色計(jì)96孔板移液槍離心管離心管盒

一、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至zui適濃度（1～10 μg /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過(guò)夜，或37℃水浴3小時(shí)，貯存冰箱。

二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 

三、每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本，37℃作用1～2小時(shí)。

四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

五、加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37℃作用1～2小時(shí)或由預(yù)試實(shí)驗(yàn)確定作用時(shí)間。

六、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

七、加入0.2ml底物溶液于每個(gè)凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。

八、加終止劑：每凹孔加2M H₂SO₄或2 M檸檬酸0.05 ml。

九、觀(guān)察記錄結(jié)果：目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（OPD用492nm）OD值。

一、ELISA的影響因素

1.  固相載體

可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中zui常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。

由于微量反應(yīng)板所用試劑量少，操作方便，適合于大規(guī)模應(yīng)用。國(guó)產(chǎn)聚苯乙烯微量反應(yīng)板（上海塑料三廠(chǎng)出品）目前已大量應(yīng)用于ELISA測(cè)定，并且獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果。但每批微量反應(yīng)板對(duì)抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。實(shí)驗(yàn)證明，吸附效果似乎與塑料的類(lèi)型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過(guò)程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至*喪失吸附能力。

因此，對(duì)每批制品在使用前，必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室鑒定，鑒定的方法和標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)每批購(gòu)置的微量反應(yīng)板或塑料管抽樣，用0.2 ug/ml純化的正常人IgG進(jìn)行包被，經(jīng)洗滌后加酶標(biāo)記抗人球蛋白進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)孵育洗滌，加底物顯色終止反應(yīng)后，逐孔在酶標(biāo)比色計(jì)中測(cè)定其消光值、光密度（OD值）。一般認(rèn)為全板中每?jī)煽组gOD值的誤差不超過(guò)10%為合格。如果中間孔與四周孔OD值相差太大，或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的OD值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽(yáng)性和陰性參考血清OD值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格，微量反應(yīng)板或塑料管在使用前并不一定通過(guò)特殊處理。用蒸餾水沖洗即可應(yīng)用。

2.  抗原

在ELISA中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來(lái)源和制備方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。

經(jīng)試驗(yàn)證明，適用于其他血清學(xué)試驗(yàn)的抗原并非均適合用于ELISA法。因此，對(duì)某一疾病的診斷，必須通過(guò)實(shí)踐，才能選出適用的抗原。對(duì)大多數(shù)傳染病和寄生蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷中所用的抗原并非要求十分嚴(yán)格，一般能用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超聲波抗原、凍融抗原、細(xì)菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、細(xì)菌的外毒素以及用表面活性劑(如SDS)所提取的抗原等，在作ELISA時(shí)，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。

此外，對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等，它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時(shí)也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時(shí)選擇的濃度要適當(dāng)。如濃度太高，則低效價(jià)抗體可能測(cè)不出來(lái)，或包被過(guò)量形成多層抗原吸附，故在操作過(guò)程中可能脫落從而降低敏感性和可重復(fù)性。

用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì)，而且可以克服前帶現(xiàn)象。那么用多大濃度抗原進(jìn)行包被zui為合適呢？可通過(guò)棋盤(pán)滴定法進(jìn)行測(cè)定，但用單項(xiàng)滴定法更為簡(jiǎn)便，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板，再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應(yīng)后分別測(cè)定OD值，選擇OD值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。

抗原包被固相載體除濃度外，對(duì)時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時(shí)間可縮短，溫度低可延長(zhǎng)包被時(shí)間。但為了方便起見(jiàn)，通常采用4℃包被過(guò)夜，可使抗原吸附得更加*且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時(shí)，在堿性條件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過(guò)夜較為合適。但在某些試驗(yàn)中，如用LPS或毒素蛋白包被時(shí)，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿(mǎn)意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10 ug/ml，而對(duì)某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適，但均應(yīng)通過(guò)滴定。