使用一抗的直接 ELISA 實驗方案

[使用一抗的直接 ELISA 實驗方案] 實驗試劑 1. 碳酸氫鹽/碳酸鹽包被緩沖液 (100 mM) 應(yīng)將抗原或抗體在包被緩沖液中稀釋，從而將它們固定到孔上： 3.03 g Na2CO3 6.0 g NaHCO3 1000 ml 蒸餾水 pH 9.62. PBS: 1.16 g Na2HPO4 0.1 g KCl 0.1 g K3PO4 4.0 g NaCl (500 ml 蒸餾水) pH 7.43. 封閉液： 常用的封閉劑為溶于 PB [一抗 直接 ELISA 抗原 包被 緩沖液]

實驗試劑

1. 碳酸氫鹽/碳酸鹽包被緩沖液 (100 mM)
應(yīng)將抗原或抗體在包被緩沖液中稀釋，從而將它們固定到孔上：
3.03 g Na2CO3
6.0 g NaHCO3
1000 ml 蒸餾水
pH 9.6

2. PBS:
1.16 g Na2HPO4
0.1 g KCl
0.1 g K3PO4
4.0 g NaCl (500 ml 蒸餾水) pH 7.4

3. 封閉液：
常用的封閉劑為溶于 PBS 的 1% BSA、血清、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠。

4. 洗滌液：
通常為 PBS 或含洗滌劑例如 0.05% (v/v) Tween20 的 Tris 緩沖生理鹽水 (pH 7.4) (TBST)。

5. 抗體稀釋緩沖液：
應(yīng)在 1x 封閉液中稀釋一抗和二抗，以降低非特異性結(jié)合。

實驗步驟

1. 將抗原包被到微孔板

1)將抗原在 PBS 或其它碳酸鹽緩沖液中稀釋至 20 μg/ml 的zui終濃度。移取 50 μl 抗原稀釋液到 PVC 微量滴定板的*排微孔中，使該微量滴定板的微孔上包被抗原。按需要在微量滴定板上進(jìn)行梯度稀釋。

通常將含純抗原的試樣以低于 2 μg/ml 的濃度加到微量滴定板上。純?nèi)芤翰皇潜匦璧模窃瓌t上，試樣中超過 3% 的蛋白質(zhì)應(yīng)為靶蛋白（抗原）。抗原蛋白質(zhì)濃度不應(yīng)超過 20 μg/ml，因為這將使微量滴定板上的大部分可用位點(diǎn)飽和。

2)

2)

確保樣品所含抗原的濃度在抗體檢測范圍內(nèi)。

3)用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時，或在 4℃下孵育過夜。包被孵育時間可能需要某些優(yōu)化。

4)棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBS。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。

2. 封閉

1)每孔添加 200μl 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。替代封閉劑包括 BlockACE 或 BSA。

2)用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少 2 小時，或如更方便的話，則在 4℃下孵育過夜。

3)用 PBS 洗滌微量滴定板兩次。

3. 用抗體孵育

1)添加 100 μl 抗體，其剛在使用前在封閉緩沖液中稀釋成濃度（依照制造商說明書）。

2)用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時。此孵育時間可能需要優(yōu)化。2 小時通常足以獲得強(qiáng)信號，但如若獲得弱信號，則當(dāng)在 4℃下孵育過夜時往往會觀察到更強(qiáng)的染色。

3)用 PBS 洗滌微量滴定板四次。

4. 檢測

1)使用多道移液器或多檔移液器為每孔分配 100 μl（或 50 μl）底物溶液。

2)待顯色充分后（如有必要），將 100 μl 終止液添加到微孔。

3)用酶標(biāo)儀讀取每孔的吸光度（光密度）。
注意：某些酶底物被認(rèn)為是有害的（潛在致癌物），因此始終要小心處理并佩戴手套。

5. 數(shù)據(jù)分析

由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度標(biāo)在 X 軸（對數(shù)標(biāo)度）上，而吸光度標(biāo)在 Y 軸（線性標(biāo)度）上。通過內(nèi)插法在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品濃度。