總蛋白定量方法簡介及優(yōu)缺點(diǎn)

蛋白質(zhì)定量是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)*的部分，該技術(shù)被廣泛的用于多個領(lǐng)域和行業(yè)，包括生物學(xué)科、食品檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)、疾病診斷等。在實(shí)際應(yīng)用操作過程中，對樣本中蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，是常用且重要的工作。盡管目前有多種總蛋白定量的方法，但是由于蛋白質(zhì)種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量差異大，且功能各異，暫無理想而通用的蛋白質(zhì)定量分析方法。現(xiàn)介紹目前常用的定量方法以及優(yōu)選點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)工作者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選取合適的定量方法。

蛋白定量法可分為以下兩大類，化學(xué)檢測法，包括福林-酚法（Lowry）、二喹啉甲酸法（BCA）、凱氏定氮法（Kjeldahl）、雙縮脲法（Biuret）、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）；光學(xué)檢測法，包括紫外光檢測和熒光檢測等?，F(xiàn)簡單介紹常用的二喹啉甲酸法（BCA法和紫外光檢測法。

1.. 二喹啉甲酸法

原理：Lowry法的改進(jìn)方法，原理為蛋白質(zhì)分子中肽鍵與二價銅離子形成絡(luò)合物，并還原成亞銅離子（一價銅）。BCA在堿性條件下能與亞銅離子形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，復(fù)合物在562nm處有高的光吸收值。蛋白濃度范圍約在5-200ug/ml。原理圖如下：

優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確靈敏（微量檢測的靈敏度可達(dá)0.5ug/ml），測定快速簡便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。干擾物質(zhì)少，試劑及其形成的顯示復(fù)合物穩(wěn)定性好，檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)較小。

缺點(diǎn)：⑴對去污劑敏感：TWEEN，Triton X-100，SDS。⑵蔗糖，尿素，銨鹽，EDTA影響測定結(jié)果。⑶zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品結(jié)果差異較大，無可比性。

2.紫外光檢測

原理：蛋白質(zhì)分子中酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在280nm處具有紫外吸收，其吸光度值與苯環(huán)中共軛雙鍵的含量成正比,檢測zui低濃度可達(dá)到10ug/ml。

優(yōu)點(diǎn)：簡便，靈敏，快速，不消耗樣品。測定后能回收。

缺點(diǎn)：⑴測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度和專一性較差。

⑵干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤，嘧啶和核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。