*ELISA快速檢測試劑盒使用說明書
一、檢測原理
本試劑盒是利用競爭ELISA方法，在酶標板微孔上預包被抗*抗原。檢測時，加入標準品或樣品溶液，*抗體及酶標記物，包被抗原和加入樣本中的*藥物競爭性地與*抗體結合后，再與酶標記物形成抗原抗體復合物，用TMB底物顯色；加入反應終止液，在450nm波長酶標儀下進行檢測，樣品中的*濃度與吸收光強度成反比。
二、檢測范圍
本試劑盒是應用ELISA技術研發(fā)的藥物殘留檢測產(chǎn)品,與儀器分析技術比較，能經(jīng)濟、快速地檢測出畜禽組織、蜂蜜、牛奶中的*
規(guī) 格：96孔/盒
靈 敏 度： 0.1ppb
檢測時間：75min
樣本檢測下限：
畜禽組 織（雞、鴨、豬肉等）…………………… 2ppb
蜂蜜、牛奶………………………………………… 2ppb
樣本回收率
畜禽組 織（雞、鴨、豬肉等）……………80% ±10%
蜂蜜、牛奶…………………………………85% ±10%
交叉反應率
*…………………………100%
四、*ELISA快速檢測試劑盒組成
- 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）
- 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
- 高濃度標準液×1瓶：（1ml/瓶）100 ppb
- 酶標記物 7ml………………………紅色帽
- 200×濃縮受體 100ul…………………離心管
- 受體稀釋液 10ml ……………………綠色帽
- 抗體工作液 7ml ………………………紅色帽
- 底物A液 7ml ………………………棕色帽
- 底物B液 7ml …………………… 黑色帽
- 終 止 液 7ml …………………… 黃色帽
- 20×濃縮洗滌液40 ml ……………… 白色帽
- 2× 濃縮復溶液 50ml ·……………… 藍色帽
- 說明書 ……………………………………1份
五、【所用儀器、試劑】
儀器：微孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g ）
微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl
試 劑：Na2HPO4·12H2O、 NaH2PO4·2H2O、NaCl
六、【實驗前溶液配制】
配液1、0.02M PBS緩沖液 5.16gNa2HPO4*12H2O+0.87gNaH2PO4*2H2O
+8.5gNaCl，加入蒸餾水至1000ml）用于樣品提取。
配液2、1×復溶工作液
將2×濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復溶+1
份去離子水，用于樣本提取后的稀釋)。
配液3、洗滌液
將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
配液4 、受體工作液的配制：
取5ul的200X濃縮受體，加入1000ul 受體稀釋液混
勻即可，或按所需用量配制抗體。
七、【*ELISA快速檢測試劑盒樣本前處理步驟】
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
(a)組織/蜂蜜樣本前處理方法
- 取2±0.05g樣本與4ml 0.02MPBS緩沖液混合震蕩5min，靜置10min；3000g以上，室溫離心10min；
- 取50ul上清液，加入450ul 稀釋后的復溶液混勻，混合30s；
- 取50ul用于分析。
- 樣本稀釋倍數(shù)：20
（b）牛奶
- 取1ml牛奶樣本于離心管中，在3000r/min，4℃離心10min，去除上層脂肪。
- 取50ul上清液，加入950ul 稀釋后的復溶液混勻，混合30s
- 取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20倍
八、酶聯(lián)免疫檢測步驟
- 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
- 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
- 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
- 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加配制好的受體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。
- 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
- 加入抗體工作液50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。
- 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
- 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
- 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。
九、結果分析
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含*成負相關
1、粗略判定
用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中*G實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即：百分吸光度值（%）＝B/B0 ×100%
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以*濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中*實際含量。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索取）
- 標準曲線
B/B0 (%)
*(ppb) [µg/kg]
圖1：*檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現(xiàn)性
%CV
*(ppb) [µg/kg]
圖2：*檢測試劑盒的精密度
由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出*檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應*濃度作曲線，可以看到全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
十、注意事項
- 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
- 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
- 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
- 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
- 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
- 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
- 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
- 該試劑盒反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【儲存】
原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。
