當FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵(thiocarbmide)結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般zui多能結(jié)合15～20個，一個IgG分子可結(jié)合2～8個分子的FITC，其反應(yīng)式如下

FITC-N=C=S  +  N-H₂-蛋白質(zhì)  →  FITC-NS-C-N-H₂-蛋白質(zhì)

常用Marsshall(1958)法標記熒光抗體，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標記法或Clark等(1963)的透析標記法。

1．Marsshall法

(1)材料    抗體球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。

(2)方法及步驟   

①抗體的準備  取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當以不起泡沫為宜)5～10min。
②熒光素的準備  根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。
b．總蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．熒光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。
f． PBS量D-(B+F)=Gml。

注：A為蛋白含量，mg／ml；B為蛋白質(zhì)溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數(shù)，mg；正為熒光素的量，mg；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml。
 ③結(jié)合(或標記)  邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內(nèi)加完)，加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。
 ④透析  結(jié)合完畢后，將標記的球蛋白溶液離心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8．0緩沖鹽水透析(0～4~C)過夜。
⑤過柱  取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩沖液(pH7．2)；過濾量：12ml標記蛋白液(過濾前未透析)；收集量：20ml(稀釋1．7倍左右)。

2．Chadwick法

(1)試劑和材料    抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、離心機及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無菌吸管，無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml）透析袋等。

(2)方法及步驟  

①抗體準備  用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nèi)，放于冰槽中。
 ②熒光色素準備  按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0．01rug計算，稱取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解。
③將準備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在o～4~C冰箱中結(jié)合(在磁力攪拌機上持續(xù)攪拌)18～24h。
④透析和柱層析  方法同Marsshall法。

3．改良法

(1)試劑和材料  

①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸餾水
②0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液配法  取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。
③3％碳酸鈉水溶液配法  稱L 5g*充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
④其他試劑和材料  l％*、離心機及離心管、燒杯(25m1)、攪拌器、無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500m1)透析袋等。

(2)方法及步驟   

①取價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0．15mol／LNaCl)及緩沖液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃。

②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白：熒光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4℃下電磁攪拌12～14h。

③然后用半飽和的硫酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler試劑測驗，至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。

④將制備好的熒光抗體加*o．01％，分裝在lml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可達2年以上。

4．透析標記法

此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。

(1)試劑和材料   試劑和材料同改良法。

(2)方法及步驟

①用0．025mol／L碳酸鹽緩沖液pH9．0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1％濃度，裝入透析袋中。

②用同一緩沖液將FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。

③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4~C電磁攪拌下透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用SephadexG50凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝，貯存于4℃中。