Oct-4過表達(dá)慢病毒包裝純化實驗

摘要：本實驗使用四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)獲得高滴度的過表達(dá)human Oct-4基因的慢病毒顆粒。病毒滴度的檢測使用qPCR定量檢測慢病毒在細(xì)胞基因組中的整合拷貝數(shù)，能夠嚴(yán)謹(jǐn)客觀地反應(yīng)慢病毒的感染和整合能力。該慢病毒系統(tǒng)中外源基因的表達(dá)框為pLenti–CMV- Oct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro：CMV啟動子驅(qū)動Oct-4-EGFP基因的表達(dá)， 同時由PGK啟動子驅(qū)動puromycin抗性基因的表達(dá)。其中EGFP可以用于觀察慢病毒的工作狀況，Puromycin抗性基因可以用于快速篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。
關(guān)鍵詞：四質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，Oct-4-EGFP，高滴度慢病毒包裝，慢病毒純化，qPCR

一、 實驗原理
慢病毒(Lentivirus) 載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。
慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長期、穩(wěn)定表達(dá)。
所以，在體外實驗及體內(nèi)實驗的研究中，慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一， 并且正在獲得越來越廣泛的應(yīng)用。

二、 實驗?zāi)康?/strong>
使用四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)獲得高滴度的過表達(dá)human Oct-4基因的慢病毒顆粒，用于研究Oct-4基因功能學(xué)研究。

三、 實驗步驟
1. 載體選擇及構(gòu)建（構(gòu)建方法詳見第4頁）：
                                           

                                                                                              pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro圖譜：

2. 病毒包裝：
包裝細(xì)胞準(zhǔn)備：
1) 細(xì)胞復(fù)蘇：
a) 準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)臏缇囵B(yǎng)瓶，標(biāo)上細(xì)胞系名稱、傳代數(shù)和日期。
b) 液氮罐中取出凍存的細(xì)胞，并在密封容器中轉(zhuǎn)移到實驗室中。
c) 將細(xì)胞從容器中拿出到適當(dāng)溫度中的水浴箱中，用37℃水浴。只浸沒凍存管的下半部分，解凍到凍存管中只剩少量固體，通常需要  
1-2min，迅速轉(zhuǎn)移到生物安全柜中。
d) 用70%酒精棉擦拭凍存管的外部，并無菌打開凍存管。
e) 慢慢的用移液管逐滴移至37℃溫育過的培養(yǎng)液中，用以稀釋凍存液中的DMSO。
f) 在37℃，5%CO2中進(jìn)行培養(yǎng)。
g) 24h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果有必要需進(jìn)行傳代。
2) 細(xì)胞傳代：
a) 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，評估細(xì)胞匯合的程度以及確認(rèn)無細(xì)菌和真菌污染。
b) 移去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。
c) 相當(dāng)于培養(yǎng)液體積一半的PBS清洗單層細(xì)胞，一般三次即可。
d) 按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%*消化單層細(xì)胞。搖晃培養(yǎng)瓶使其*覆蓋細(xì)胞單層，倒出多余的*。
e) 將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱，放置2-10min。
f) 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞以確保所有細(xì)胞都分離且漂浮，輕拍培養(yǎng)瓶的一側(cè)來釋放殘留的貼壁細(xì)胞。
g) 用少量的含新鮮血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞以滅活*，取出100-200μl用于計數(shù)。
h) 將所需數(shù)量的細(xì)胞移至一個新標(biāo)記好的含溫育過培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中或者培養(yǎng)板上；選擇適當(dāng)培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞系。
i) 按照細(xì)胞系的生長特性重復(fù)該步驟，直到細(xì)胞狀態(tài)良好、無污染，可以鋪板使用，其余選擇凍存。
3) 活細(xì)胞計數(shù)：
a) 取一瓶傳代的細(xì)胞，待長成單層以后使用；細(xì)胞懸液的制備方法：用0.25%的*消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等*），吹打制成待測細(xì)胞懸液。
b) 蓋好蓋玻片，取一套血球計數(shù)槽，制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸適量細(xì)胞懸液到離心管中，加入等體積臺盼藍(lán)染液，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。若僅是單純的進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，不考慮細(xì)胞的活力，則可不使用臺盼藍(lán)染色。
c) 將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板，注意蓋玻片下不要有氣泡，也不要懸液流入旁邊槽中。
d) 統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)，將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的大格（每格含有16個中格）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。
e) 計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)。按照下面公式計算細(xì)胞密度：
（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml=（四個大格子細(xì)胞數(shù)/4）×2×104
說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。
公式中乘以2因為細(xì)胞懸液于染液1：1稀釋。
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）=0.1mm3；1ml=1000mm3
4) 細(xì)胞凍存：
用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，評估細(xì)胞密度以及確認(rèn)無細(xì)菌和真菌污染，移去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用相當(dāng)于培養(yǎng)液體積一半的PBS清洗單層細(xì)胞，一般三次即可，按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%*消化單層細(xì)胞。搖晃培養(yǎng)瓶使*覆蓋細(xì)胞單層。倒出多余的*，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱，放置2~10min，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞以確保所有細(xì)胞都分離且漂浮，輕拍培養(yǎng)瓶的一側(cè)來釋放殘留的貼壁細(xì)胞，用少量的含新鮮血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞以滅活*。取出100~200μl用于計數(shù)。為了凍存后有好的復(fù)蘇效果，理想細(xì)胞的存活率應(yīng)超過90%。將剩余的細(xì)胞150g離心5min，在凍存培養(yǎng)液中，以2~4×106個細(xì)胞/ml的密度重懸細(xì)胞，吸取1ml細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至標(biāo)有細(xì)胞系名稱、傳代次數(shù)的凍存管中，將凍存管放置凍存盒中放入-80℃冰箱過夜，zui后將冷凍的凍存管轉(zhuǎn)移到液氮的氣相層內(nèi)存放，并記錄位置。

包裝過程：
1) 轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種到100mm dish中，控制細(xì)胞轉(zhuǎn)染時的密度為70-80%。
2) 轉(zhuǎn)染前一小時取出細(xì)胞培養(yǎng)板，去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ml的Opti-MEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱。
3) 制備轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的復(fù)合物： 
? 將待轉(zhuǎn)染的病毒載體質(zhì)粒32μg（骨架質(zhì)粒：穿梭質(zhì)粒=1:1）溶于Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為500μl，輕輕混勻，靜置5min。 
? 將Obio轉(zhuǎn)染試劑溶于Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為500μl，輕輕混勻，靜置5min。 
? 將Obio轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加到質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊輕輕混勻后在室溫放置20min，使DNA和Obio轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合體。
? 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，將上面配好的DNA- Obio轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，做好標(biāo)記，放回培養(yǎng)箱。
? 6h后吸去培養(yǎng)基，PBS洗一次，加入10ml新鮮*培養(yǎng)基培養(yǎng)。
關(guān)于病毒轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染信息，請登陸：http://www.oobio.com.cn/。
包裝熒光拍照質(zhì)控結(jié)果：

收毒：
1) 轉(zhuǎn)染48h后，*次收毒，收集培養(yǎng)基至50ml離心管中，做上標(biāo)記，并給細(xì)胞更換新鮮的*培養(yǎng)基。
2) 轉(zhuǎn)染72h后，第二次收毒，收集培養(yǎng)基至50ml離心管中，做上標(biāo)記，丟棄細(xì)胞。
注：廢棄的含病毒的培養(yǎng)基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丟棄。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理，也可以用煮沸處理半小時或高壓濕熱滅菌（121℃，30min）處理。

3. 慢病毒純化：
1) 普通離心機(jī)：3500rpm，10min，RT離心后，上清馬上倒入新的50ml離心管，0.45μm，過濾上清到超速離心管中。上清分裝到12支超速離心管，兩兩對應(yīng)配平衡，不夠的體積可用不含血清的培養(yǎng)基配平。
2) 超速離心機(jī)：HITACHI，30,000rpm，2h，4℃，離心后，可觀察到管壁一側(cè)有白色的病毒沉淀，做上記號。在安全柜中，打開離心管，小心地棄上清，離心管倒扣在滅菌過的吸水紙上，棄未去除干凈的上清。每管根據(jù)沉淀量添加DPBS，80μl-120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀過夜。
3) 將同一種病毒，逐管收集法收集病毒到zui后一管，再用100μl DPBS收集2次，全部收到1.5ml 離心管中，按要求分裝病毒，標(biāo)記（病毒名稱，年-月-日）-80℃冰箱保存。

4. 慢病毒滴度檢測（Real time 定量PCR 法測定滴度）：
1) 樣品制備：
a) 消化293T細(xì)胞，按1×105細(xì)胞每孔接種24孔板。
b) 細(xì)胞貼壁后（鋪板后4~6h）加入病毒。
c) 12~20h后換液，去掉含病毒的培養(yǎng)基。
d) 感染后72h拍照記錄熒光，收集細(xì)胞抽取基因組DNA并做定量PCR實驗測定滴度。
2) Real-time PCR 檢測：
Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 來自TAKARA。
a) 下列比例配置反應(yīng)體系：
                                                        

b) 設(shè)定程序為兩步法Real-Time 定量。預(yù)變性95℃，15s，之后每一步變性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共進(jìn)行40 個循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。
Cycle 1: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:15.
Cycle 2: (40X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:05.
Step 2: 60.0 ℃ for 00:34.
Data collection and real-time analysis enabled.
c) 制作熔解曲線。PCR 結(jié)束后， 在95℃變性1min。然后冷卻至55℃，使DNA 雙鏈充分結(jié)合。從55℃開始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s， 同時讀取吸光值。
Cycle 3: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1: 55.0 ℃ for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃

3) 滴度報告：
                                                

5. 慢病毒表達(dá)檢測：
慢病毒感染工具細(xì)胞-293T，WB檢測病毒表達(dá)情況（24孔板為例）：
*天：細(xì)胞準(zhǔn)備：
將長勢良好的293T細(xì)胞接種到24孔板，消化好細(xì)胞后把細(xì)胞濃度調(diào)為1×105個/ml，按500μl/孔加入。接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞匯合率介于30-50%之間。
第二天：病毒感染：
感染實驗分兩組，按MOI 10、20加入病毒數(shù) 。加入感染增強(qiáng)劑，終濃度為5μg/ml。
第三天：換液：
感染8-12h后，棄去上清，換新鮮的*培養(yǎng)基，500μl/孔。
(注：某些特殊細(xì)胞可以更換一半病毒液后，過夜，具體請咨詢公司信箱：techservice@oobio.com.cn
第五天：觀察熒光表達(dá)情況，收集蛋白樣品，進(jìn)行WB實驗。
四、 參考文獻(xiàn)
1. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, Naldini L.A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.J Virol. 1998 Nov;72(11):8463-71.
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4. Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, Bukovsky A, Quiroz D, Naldini L, Trono D.Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.J Virol. 1998 Dec;72(12):9873-80.
5. Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ.Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors.J Virol. 1999 Apr;73(4):2886-92.