【摘要】  　　目的: 制備抗人骨橋蛋白（hOPN）的單克隆抗體（mAb）, 用于其功能研究。方法: 構(gòu)建OPN的原核表達(dá)載體pTriEx1hONP載體, 轉(zhuǎn)化Tuner(DE3)placI 感受態(tài)大腸桿菌, 用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。利用鎳柱親和層析純化OPN蛋白, 純化蛋白經(jīng)超濾濃縮洗滌后即為免疫原。以重組純化的OPN蛋白為免疫原, 免疫BALB/c小鼠, 取免疫小鼠的脾細(xì)胞和同系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0進(jìn)行常規(guī)融合, 通過有限稀釋法進(jìn)行克隆和間接ELISA篩選, 獲得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株, 通過ELISA、 Western blot等方法檢測(cè)其特異性, 并用免疫組化方法檢測(cè)了正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜OPN的表達(dá)。結(jié)果: pTriEx1hONP表達(dá)的OPN蛋白主要為可溶性形式, 經(jīng)鎳柱純化后, 蛋白純度可達(dá)85％以上。純化的OPN重組蛋白免疫小鼠后經(jīng)融合篩選, 得到2株穩(wěn)定分泌抗人OPN的mAb雜交瘤細(xì)胞株, 分別命名為1E7和5B7, 兩株mAb的免疫球蛋白亞類分別IgG1和IgG2a。通過ELISA和Western blot等方法鑒定, 抗OPN的mAb能與OPN蛋白特異性結(jié)合。通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)不同時(shí)期的正常子宮內(nèi)膜的OPN的檢測(cè)表明, 子宮內(nèi)膜腺上皮在增生期、 分泌早期, OPN呈 弱陽(yáng)性表達(dá); 分泌中、 晚期OPN呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論: 以純化的重組hOPN為免疫原成功制備了鼠抗hOPN的mAb, 并初步進(jìn)行了應(yīng)用, 為研究hOPN的功能打下了良好基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】  骨橋蛋白; 原核表達(dá); 單克隆抗體

　　骨橋蛋白（osteopontin, OPN）是一種機(jī)體反應(yīng)性的多功能磷酸化糖蛋白, 具有**天冬氨酸（arginineglycineaspartic acid, RGD）序列, 可通過該序列與整合素和CD44結(jié)合, 參與細(xì)胞的黏附、 遷移等［1］。OPN功能復(fù)雜多樣, 與免疫系統(tǒng)、 腫瘤轉(zhuǎn)移、 消化系統(tǒng)、 泌尿系統(tǒng)、 生殖系統(tǒng)、 骨組織等關(guān)系密切, 參與疾病的發(fā)生［2, 3］。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜、 蛻膜等生殖系統(tǒng)也表達(dá)OPN, OPN在胚胎的著床、 生長(zhǎng)發(fā)育及分化等方面也起著重要作用, 因此OPN在生殖系統(tǒng)疾病中的作用值得近一步研究［4］。我們通過構(gòu)建OPN的原核表達(dá)載體, 表達(dá)純化OPN蛋白并制備小鼠抗人OPN蛋白單克隆抗體(mAb）, 用于OPN的檢測(cè), 以進(jìn)一步研究OPN與生殖疾病的關(guān)系。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  克隆用大腸桿菌DH5α本室保存。表達(dá)質(zhì)粒pTriEx1、 含人OPN cDNA的質(zhì)粒pET28ahOPN及表達(dá)用大腸桿菌Tuner（DE3）placI由哈佛大學(xué)劉思金博士惠贈(zèng)。6～8周齡的BALB/c小鼠（雌性）,  購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)*動(dòng)物所。

　　1.2  方法

　　1.2.1  表達(dá)載體的構(gòu)建  根據(jù)OPN基因序列NCBI（Accession Number:  NM_000582）設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增人OPN基因編碼序列全長(zhǎng): PCR上游引物P1為5′CGGGAGCTCCCAGATGCTGTGGCCACATG3′,  引入Sac I酶切位點(diǎn), 下游引物P2為5′GTGCTCGAGATTGACCTCAGAAGATGCAC3′引入Xho I 酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增部分為 hOPNcDNA序列（Accession Number:  NM_000582）的2741065位核苷酸。以pET28ahOPN為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 3 min, 然后94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃  1 min 循環(huán), 共30個(gè)循環(huán), zui后72℃延伸10 min, PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收后和pTriEx1均以Sac I和Xho I酶切并純化, 二者用T4 DNA連接酶16℃連接過夜, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 將菌液涂布于含100 mg/L氨卞*的LB平板, 篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)一步用PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。

　　1.2.2  OPN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化  挑取鑒定正確的pTriEx1hONP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tuner（DE3）placI, 挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆接種于含有5 mL  LB培養(yǎng)基（含氨芐*100 mg/L, 10 g/L的葡萄糖）中, 37℃ 250 r/min 搖菌至A值達(dá)0.5左右時(shí), 加入濃度為1 mmol/L的IPTG, 誘導(dǎo)3 h后離心收集菌體, 同時(shí)在誘導(dǎo)前取樣作為對(duì)照。收集的菌體經(jīng)超聲裂解后取上清和沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE電泳, 考馬斯亮蘭染色分析。按上述方法對(duì)pTriEx1hONP進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白, 取出培養(yǎng)物5 000 r/min離心收集細(xì)胞, 超聲破碎細(xì)胞, 鎳離子金屬鰲合柱（NiNTA）純化目的蛋白, 收集洗脫液, 經(jīng)SDSPAGE鑒定后超濾管超濾濃縮洗滌后備用。

　　1.2.3  鼠抗人OPN mAb的制備  純化后的OPN抗原與等體積的*弗氏佐劑混合, 充分?jǐn)嚢柚敝脸蔀橛桶? 腹部皮下多點(diǎn)注射。每只小鼠注射20 μg抗原, 共注射5只小鼠。2周后同劑量抗原加福氏不*佐劑加強(qiáng)免疫, 加強(qiáng)免疫2次。后一次加強(qiáng)免疫7 d后以間接ELISA檢測(cè)小鼠血清抗人OPN多抗的效價(jià), 效價(jià)高者尾靜脈再?zèng)_擊免疫1 次, 每只20 μg, 3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合。將免疫小鼠的脾細(xì)胞懸液與體外培養(yǎng)的Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞以5∶1的比例在聚乙二醇作用下按常規(guī)法融合, 采用有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。以重組純化的人OPN蛋白作為抗原（0.4 mg/L）包被酶標(biāo)96孔板, 間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清, 所測(cè)的A490比陰性對(duì)照高10倍的克隆, 進(jìn)行亞克隆化, 并進(jìn)行擴(kuò)增凍存。經(jīng)過3次有限稀釋克隆化, 將分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系大量擴(kuò)增并凍存, 長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后, 以相同的方法再次克隆化鑒定之。

　　1.2.4  mAb生物學(xué)特性的分析和鑒定  （1）mAb的Ig亞類鑒定: 取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液, 用Roch公司提供的IsoStripTM鼠mAb亞類檢測(cè)試劑盒進(jìn)行IgG亞類鑒定。具體操作過程按照說明書進(jìn)行。（2）應(yīng)用Western blot測(cè)定mAb的特異性。將純化的重組人OPN和pTriEx1hONP轉(zhuǎn)化Tuner（DE3）placI誘導(dǎo)后的菌體蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳, 電轉(zhuǎn)至PVDF膜上, 用50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜, 加入抗人OPN mAb, 室溫反應(yīng)1 h , TBST（0.1 mol/L Tris.Cl, pH7.5,  0.5 mL/L Tween20）緩沖液洗膜3次, 加入羊抗鼠IgGHRP抗體（1∶10 000稀釋）, 室溫下孵育1 h, TBST洗滌3次。ECL法顯色。（3）mAb效價(jià)的檢測(cè): 常規(guī)方法誘生小鼠mAb腹水, 離心取上清分裝, 凍存于-70℃。應(yīng)用Protein G免疫親和層析法純化mAb, 方法按Pharmaeia公司方法進(jìn)行。以純化OPN 10 mg/L包被酶標(biāo)板, 常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)純化血清效價(jià)。（4）相加實(shí)驗(yàn): 取上述包被好的抗原酶標(biāo)孔, 取2株陽(yáng)性單克隆孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗, 進(jìn)行間接ELISA反應(yīng), 測(cè)定反應(yīng)顯色后的A490值, 按公式計(jì)算它們的相加系數(shù): AI=［2A1+2/(A1+A2)-1］×100%, 其中A1+2為相加孔吸光值, A1、 A2為非相加孔的吸光值。AI接近100%, 則2個(gè)mAb識(shí)別不同的抗原表位, AI接近0, 則2個(gè)mAb識(shí)別相同的抗原表位。

　　1.2.5  免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)子宮內(nèi)膜OPN的表達(dá)  正常人子宮內(nèi)膜經(jīng)常規(guī)方法固定、 包埋、 切片、 脫蠟、 至水后, PBS洗3次,  30 mL/L H2O2甲醇溶液室溫孵育10 min, PBS洗滌后微波抗原修復(fù), PBS洗滌后加100 mL/L的山羊血清37℃封閉20 min, 加入雜交瘤培養(yǎng)上清, 4℃孵育過夜, PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP, 37℃孵育30 min, PBS洗片后進(jìn)行DAB顯色, 蘇木素復(fù)染, 返藍(lán)后封片。

　　2  結(jié)果

　　2.1  重組質(zhì)粒pTriEx1hOPN的構(gòu)建和鑒定  以pET28ahOPN為模板, 擴(kuò)增人OPN的全長(zhǎng)791 bp, 與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。將hOPN亞克隆到原核表達(dá)載體pTriEx1多克隆位點(diǎn)中（Sac I和Xho I）。重組克隆經(jīng)酶切及PCR鑒定, 目的片段大小與預(yù)期相符（圖2）。測(cè)序結(jié)果顯示目標(biāo)序列與NCBI（Accession Number:  NM_000582）相應(yīng)序列相符, 證實(shí)表達(dá)載體pTriEx1hOPN構(gòu)建成功。

　　2.2  hOPN融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化  pTriEx1hOPN陽(yáng)性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDSPAGE電泳顯示: 在37℃、 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h條件下, 融合蛋白表達(dá)達(dá)到高峰, 蛋白條帶位于Mr約55 000處（比計(jì)算的Mr大）。該重組蛋白主要以可溶性形式存在, 用鎳離子金屬鰲合柱（NiNTA）層析柱純化后, 蛋白濃度證實(shí)純度在85%以上(圖3)。

　　圖1  OPN PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（略）

　　1: DNA marker DL 2000; 2: PCR擴(kuò)增的人OPN片段.

　　圖2  pTriEx1hONP酶切鑒定（略）

　　1: DNA marker(λDNA/Hind III+EcoR I); 2:  Sac I和Xho I雙酶切重組質(zhì)粒pTriEx1hOPN.

　　圖3  重組蛋白的SDSPAGE分析（略）

　　M: 蛋白質(zhì)marker;  1, 2:  pTriEx1轉(zhuǎn)化Tuner（DE3）placI誘導(dǎo)前的上清和沉淀; 3, 4:  pTriEx1轉(zhuǎn)化Tuner（DE3）placI誘導(dǎo)后的上清和沉淀; 5, 6:  pTriEx1hOPN轉(zhuǎn)化Tuner（DE3）placI誘導(dǎo)前的上清和沉淀; 7, 8:  pTriEx1hOPN轉(zhuǎn)化Tuner（DE3）placI誘導(dǎo)前的上清和沉淀; 9: 純化的OPN蛋白.

　　2.3  特異性分泌鼠抗人OPN mAb的雜交瘤細(xì)胞株的建立  按常規(guī)方法以重組人OPN蛋白為免疫小鼠后進(jìn)行細(xì)胞融合, 將融合10塊96孔培養(yǎng)板, 融合率約為85％。將復(fù)測(cè)為陽(yáng)性的克隆連續(xù)3次克隆化培養(yǎng), 獲得2株持續(xù)分泌特異性抗人OPN mAb的雜交瘤細(xì)胞株, 分別命名為1E7和5B7。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng), 液氮凍存半年后復(fù)蘇, 仍生長(zhǎng)良好, 分泌抗體性能穩(wěn)定。

　　2.4  mAb的特性分析及鑒定  1E7和5B7 mAb的免疫球蛋白亞類分別IgG1和IgG2a, 二者輕鏈均為κ型。經(jīng)Western blot證實(shí)2株抗體均可特異性結(jié)合表達(dá)的OPN蛋白（圖4）。用間接ELISA檢測(cè)該2株抗體的效價(jià)為1∶10 000以上。相加實(shí)驗(yàn)測(cè)得mAb細(xì)胞株1E7和5B7培養(yǎng)上清的相加系數(shù)接近于100%, 說明2個(gè)mAb可識(shí)別OPN的不同抗原表位。

　　2.5  OPN在正常人子宮內(nèi)膜的表達(dá)  免疫組化顯示在子宮內(nèi)膜腺上皮的增生期和分泌早期, 骨橋蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá)（圖、 B）, 分泌中期和分泌晚期骨橋蛋白在腺上皮腔面, 皆呈中等強(qiáng)度和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖5C、  D）, 血管內(nèi)皮細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá), 整個(gè)月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)骨橋蛋白。在同一標(biāo)本中各腺體及腺細(xì)胞染色不均勻, 但陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均在50%以上。

　　圖4  OPN mAb的Western blot 鑒定（略）

　　1: pTriEx1hOPN轉(zhuǎn)化Tuner（DE3）placI后的誘導(dǎo)上清;  2: 純化的 OPN蛋白.

　　圖5  OPN在正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)（免疫組化, ×100）（略）

　　A: 增殖期子宮內(nèi)膜; B: 分泌早期子宮內(nèi)膜; C: 分泌中期子宮內(nèi)膜; D: 分泌晚期子宮內(nèi)膜.

　　3  討論
    　　
　　近年來OPN表達(dá)與生殖的關(guān)系逐漸受到人們的重視, 但對(duì)OPN在子宮內(nèi)膜中表達(dá)的具體作用知之甚少。OPN作為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白, 通過在細(xì)胞－細(xì)胞間, 細(xì)胞與ECM間的相互作用中起著重要作用, 幾乎參與了生殖的全過程: 受精, 著床及胎盤的形成, 并在胎盤和子宮的連接、 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用［5］。OPN表達(dá)過量或不足均可能引起疾病, 如不明原因的不孕, 或子宮內(nèi)膜異位癥等。zui近有報(bào)道稱子宮內(nèi)膜異位證患者的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜均較正常人子宮內(nèi)膜OPN表達(dá)水平高。OPN可能在子宮內(nèi)膜的侵襲、 轉(zhuǎn)移中起了重要作用, 也可能由于子宮內(nèi)膜高表達(dá)OPN, 使機(jī)體對(duì)OPN的免疫應(yīng)答狀態(tài)發(fā)生了變化。我們用構(gòu)建的pTriEx1hOPN轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tuner（DE3）placI后成功表達(dá)出OPN蛋白, 我們所表達(dá)的重組OPN蛋白在SDSPAGE電泳中表現(xiàn)Mr為55 000, 大于其計(jì)算Mr（33 000）。OPN的這種異常電泳行為與Helluint等［6］的報(bào)道一致。我們經(jīng)免疫融合篩選后獲得2株抗人OPN特異性mAb, 用間接ELISA方法測(cè)得其純化腹水效價(jià)均在1∶10 000以上, 且為識(shí)別OPN不同抗原表位的mAb, 可能用于雙抗體夾心法測(cè)定OPN的水平。通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)不同時(shí)期的正常子宮內(nèi)膜的OPN的檢測(cè)表明, 子宮內(nèi)膜腺上皮在增生期、 分泌早期, OPN呈弱陽(yáng)性表達(dá); 分泌中、 晚期OPN呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá), 與有關(guān)報(bào)道一致［7］?？谷薕PN mAb的成功制備不但具有良好的臨床應(yīng)用前景, 也為我們進(jìn)一步研究OPN表達(dá)與生殖疾病的關(guān)系打下了良好基礎(chǔ)。

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