一、實驗原理

植物患病組織內的真菌菌絲體，如果給予適宜的環(huán)境條件，除個別種類外，一般都能恢復生長和繁殖。植物病原菌的分離就是指通過人工培養(yǎng)，從染病植物組織中將病原真菌與其它雜菌相分開，并從寄主植物中分離出來，再將分離到的病原菌于適宜環(huán)境內純化，這個過程總稱植物病菌的分離培養(yǎng)。植物病原真菌的分離一般都是采用組織分離法，就是切取小塊病組織，經(jīng)表面消毒和滅菌水洗過后，移到人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

二、實驗目的

植物病原菌的分離培養(yǎng)是植物病理學實驗zui基本的操作技術之一，它對原害鑒定，病原形態(tài)觀察、植物病害接種體的培養(yǎng)等方面都是經(jīng)常使用的研究手段。通過本實驗，要求植物病原菌分離培養(yǎng)的一般原則和方法。

三、實驗材料及準備

1．分離材料：梨黑斑病(Alternaria kikuchiana)，柿樹圓斑病(Pestnlotia sp)及杉木炭疽病(Glomerella cingolata)新發(fā)病的病葉；楊樹爛皮病(Cytospora chrysosperma)國槐腐爛病(Dothiorella sp.)的帶有新病斑的枝條；油松種子。

2．分離用具(每小組為單位)

酒精燈4個，*4把，*4把，PDA培養(yǎng)基3瓶，培養(yǎng)皿(Φ9cm)24套，小燒杯(5ml)4個，大燒杯1個，斜面培養(yǎng)基12管，滅菌水4瓶，75%酒精瓶1個(內放脫脂棉球)0.1%升汞瓶1個，5%乳酸瓶(60ml)1個，火柴1盒，濕、干紗布各4張。

四、實驗方法及步驟

(一)分離前的準備工作

1．工作環(huán)境的清潔和消毒

分離培養(yǎng)一般在無菌室、無菌箱或無菌工作臺(超凈工作臺)上進行，無菌室和無菌箱要經(jīng)過噴霧除塵，并用藥物或紫外線照射消毒(常用消du藥物為70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等噴霧。若用紫外線燈照射則需20-30分鐘)。在沒有上述設備條件時，在清潔房間里關閉門窗，避免空氣流動，經(jīng)過噴霧除去空氣及地面灰塵后進行操作，也可獲得較好的結果。工作前擦凈桌面，鋪上濕紗布。將所需用的物品按次序放在工作臺上，避免工作時走動，工作人員穿上滅菌后的工作服，帶上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新潔爾滅擦手。

2．分離用具的消毒

凡是和分離材料接觸的器皿(刀、剪、鑷、針等)都要隨時(至少在使用時)保持無菌，將這些用具浸于70%酒精中，使用時在燈焰上滅菌燒去酒精，如此2-3次(刀、剪、鑷等不宜在燈焰上燒時過長，以防退火)。再次使用時必須重復滅菌。培養(yǎng)皿、試驗等要經(jīng)過干熱滅菌。培養(yǎng)基及洗滌或稀釋用蒸餾水都需要事先經(jīng)過高壓蒸氣滅菌。

3．分離材料的選擇

用新發(fā)病的植株、器官或組織做為分離材料，可以減少腐生菌的污染。任何植物壞死部分的內部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑點病害應從鄰近健全組織，即從病、健組織交界處獲得分離材料。