蛋白質(zhì)在細(xì)菌中表現(xiàn)后，以反復(fù)的冷凍-解凍方法打破細(xì)胞，再用硫酸銨把蛋白質(zhì)沉淀下來，此步驟可以去除大部份核酸、多醣、脂質(zhì)等雜物。

儀器用具：恒溫震蕩培養(yǎng)箱37℃；高速冷凍離心機(jī)及離心管 （使用20,000 rpm離心陀）使用高速離心機(jī)要注意： 離心機(jī)及離心陀的溫度要預(yù)冷*，相對(duì)位置的兩只離心管要平衡好，離心陀轉(zhuǎn)速不能超過zui高速限；液態(tài)氮及冰筒；37℃溫水浴

藥品試劑：轉(zhuǎn)型菌株pQG11/M15 [pREP] 單一菌落；LB/amp/kan 及IPTG （1 M stock）；Lysis buffer （50 mM Na3PO4·12H2O, pH 7.0; 0.1 M NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.2%Triton X-100）

使用前添加成10 mM β-mercaptoethanol, 25 μg/mL PMSF, 40 μg/mL lysozyme.Buffer A-0 （50 mM Na3PO4, pH 7.0） 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成為10 mM zui終濃度。Buffer A-150: Buffer A-0 再加有0.15 M NaCl;硫酸銨 （要烘干并以研砵磨碎）

方法步驟：

1） 挑取培養(yǎng)皿上單一菌落，培養(yǎng)在15 mL 的LB/amp/kan 液體培養(yǎng)基中，以120rpm 轉(zhuǎn)速震蕩，在37℃下培養(yǎng)過夜。

2） 取上述菌液6 mL加入300 mL新鮮LB/amp/kan培養(yǎng)基中，以120 rpm 37℃培養(yǎng)至A600 = 0.6 后，加入IPTG成為1 mM濃度，繼續(xù)以120 rpm在37℃震蕩培養(yǎng)4 h.

3） 將菌液倒入50 mL 離心管 （conical tube） 中離心10 min （5,000 rpm）。

4） 倒去上清，可將菌塊連同離心管置 -20℃冰箱貯存。

5） 取出含菌塊的離心管置碎冰上，待菌塊溶解后，以殘存液體均勻懸濁的。再

加入10 mL lysis buffer 輕輕懸浮的。

6） 將菌液放在液態(tài)氮中冷凍1 min,然后在37℃水浴中搖蕩溶解的。如此反復(fù)三次，盡量不要產(chǎn)生大量氣泡。將離心管的內(nèi)容物倒入50 mL 高速離心機(jī)的離心管內(nèi)。

7） 離心20 min （12,000 rpm, 4℃） 取上清共 _____ mL,稱為 粗抽取液 （XT）；預(yù)留100 μL 以便日后一起進(jìn)行分析。此后樣本均得放置碎冰上，以低溫進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

8） 此上清加入5 mL buffer A-0 混勻后倒入燒杯，置碎冰上放冷，不時(shí)攪拌并緩緩加入固體硫酸銨 _____ gm,使成為70%飽和度，加完后再攪拌10 min.

9） 離心20 min （12,000 rpm, 4℃） 后小心倒去上清，取白色沉淀部份。

10） 沉淀加以2 mL buffer A-150 均勻懸濁的，再以桌上型離心機(jī)去除不溶物質(zhì)，（10,000 rpm,5 min），共得 ______ mL,稱為 全蛋白質(zhì) （TP）；預(yù)留100 μL,連同上述XT 置4℃冷藏。

上海友騰生物傾力為客戶提供上萬種科研試劑，提供*、zui全、zui有效的科研試劑產(chǎn)品，質(zhì)量被全國(guó)各大院?？蒲袡C(jī)構(gòu)認(rèn)可。
 鄭重聲明：請(qǐng)客戶在取材前盡量先與我公司銷售技術(shù)人員溝通，前期的取材直接影響到您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們有成套的售前售后服務(wù)，.凡是購(gòu)買公司試驗(yàn)用產(chǎn)品，本公司無償提供。凡是購(gòu)買本公司elisa試劑盒，本公司免費(fèi)代測(cè)，產(chǎn)品耐用，性價(jià)比好，值得信賴。
服務(wù)承諾：1.凡在本司購(gòu)買elisa試劑盒的客戶，可享受我司提供免費(fèi)代測(cè)服務(wù)及中英文雙版說明書
          2.我司對(duì)售出產(chǎn)品提供完整售后服務(wù),本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!
本公司*供應(yīng)科研用elisa試劑盒，價(jià)格合理，確屬質(zhì)量問題可包換包退，免除您的后顧之憂。，如有問題可與我司業(yè)務(wù)員!我們會(huì)以zui快的速度為你解決一切問題
上海友騰公司提供各種種屬、各種系列ELISA試劑盒，于實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究用，不適用于臨床診斷。提供免費(fèi)代測(cè)服務(wù)，詳情請(qǐng)您。