（一）雙縮脲測定法

1．原理 蛋白質(zhì)中的肽鍵有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中與二價(jià)銅離子形成藍(lán)紫色的絡(luò)合物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。此法特異性強(qiáng)，游離的氨基酸、小肽和核酸均不產(chǎn)生這種反應(yīng)，但此法不夠敏感，僅能測出毫克水平。

2．試劑配制

硫酸銅（CuSO4·5H2O） 1.50g

酒石酸鉀鈉 5.00g

H2O 500.0ml

10%氫氧化鈉（不含硫酸鈉）300ml

H2O 加至 1 000ml

此溶液可長期保存，如產(chǎn)生暗紅色沉淀，則應(yīng)廢棄重配。

3．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

⑴ 準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白1.0g（必要時(shí)須首先采用凱氏定氮法測定牛血清白蛋白制品中實(shí)際純蛋白含量，然后換算），以生理鹽水配成1%的濃度。

⑵ 將1%的牛血清白蛋白按表8-1進(jìn)行稀釋：

表8-1 牛血清白蛋白稀釋方法表

成     分 試            管             號 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 
1％蛋白液（ml） 1.0 .09 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 － 
蛋白含量（mg） 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 － 
生理鹽水（ml） 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 
雙縮脲試劑（ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 
試劑蛋白含量（mg） 8.0 7.2 6.4 5.6 4.8 4.0 3.2 2.4 1.6 0.8 0

注：1%牛血清白蛋白，經(jīng)凱氏定氮測定含純蛋白為80%。
⑶ 混勻后于室溫放置0.5h～1h，光電比色（540nm），順序由低濃度至高濃度，每管測3次，求其平均值。

⑷ 以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4．樣品測定

⑴ 取樣品0.1ml，加生理鹽水1.4ml。也可將樣品做1﹕10稀釋加1ml，再加生理鹽水0.5ml。

⑵ 加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，至室溫0.5h～1h。

⑶ 另以1.5ml生理鹽水加4.0ml雙縮脲試劑作為空白對照。

⑷ 測OD540值。

⑸ 根據(jù)OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量。

注意：各種雙縮脲試劑的配法、加量及室溫靜置時(shí)間均有差異，一旦標(biāo)準(zhǔn)曲線制定后，樣品的測定則必須與標(biāo)準(zhǔn)曲線制定的條件一致，否則結(jié)果有差異。

（二）紫外光譜吸收法

1．原理 本法根據(jù)蛋白之中的芳香族氨基酸－*、*在紫外光區(qū)的吸收特點(diǎn)而建立的。蛋白質(zhì)在280nm波長附近有一吸收峰，其吸收程度與這些氨基酸的含量成正比。此法靈敏度高，可測到微克水平，操作簡單，不需要加各種試劑，測完后，樣品可回收。

2．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

⑴ 用精密天平稱取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理鹽水中。

⑵ 以生理鹽水再稀釋成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以鹽水對照。

⑶ 測各管OD280值。

⑷ 以O(shè)D280值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3．樣品測定

將待測樣品以鹽水適當(dāng)稀釋，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之間，以生理鹽水為對照，測OD280值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量。

（三）Folin酚法

1．原理 蛋白質(zhì)中的*與*和Folin酚試劑中的磷鎢酸、磷鉬酸作用后，在堿性條件下不穩(wěn)定，被還原成藍(lán)色的化合物（鉬藍(lán)）。因此通過比色即可測知標(biāo)本中的蛋白含量。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、靈敏度高，且不受溶液中脂多糖的干擾。

2．試劑

試劑甲：

A液：Na2CO3 10.00g

NaOH 2.00g

酒石酸鉀鈉（或鉀鹽鈉鹽）0.25g

混合、溶于500ml蒸餾水中。

B液：CuSO4·5H2O 0.5g

H2O 100.00ml

用前將A液50份與B液1份混合即為試劑甲。

試劑乙：

于磨口回流瓶加入下列試劑

Na2WO4·2H2O 100.00g

NaMoO4·2H2O 25.00g

H2O 700.00ml

85%H3PO4 50.00ml

濃HCl 100.00ml

按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：

硫酸鋰 150.00g

H2O 50.00ml

溴水 數(shù)滴

開口繼續(xù)沸騰15min，驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色微帶綠色（如仍呈綠色，須重復(fù)滴加液體溴步驟）。稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色瓶保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH液滴定，以*為指示劑，然后適當(dāng)稀釋（加水約1倍）使zui終濃度為1mol/L。

3．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

⑴ 取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸餾水中，使成250μg/ml。

⑵ 按表8-2稀釋。

表8-2 標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋方法

成分 試          管            號 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 
牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（ml） 0 0.2 0.2 0.4 0.1 0.6 0.6 0.8 0.8 1.0 1.0 
生理鹽水（ml） 1.0 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 
蛋白含量(μg／ml) 0 50 50 100 100 150 150 200 200 250 250

⑶ 每管加試劑甲5ml，混合后室溫放置10min，再加0.50ml試劑乙（即Folin酚試劑），立即搖勻（否則顯色降低）。

⑷ 30min后測OD650nm。

⑸ 以O(shè)D為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4．樣品測定

⑴ 待測樣品1ml（適當(dāng)稀釋至約含25μg－250μg/ml）。

⑵ 加試劑甲、乙。

⑶ 比色、測OD650值。

⑷ 查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求蛋白含量乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的蛋白含量。

（四）紫外分光測定法

A1%1cm＝13.8（IgG）(280nm)

A1%1cm＝14.5(IgM)(280nm)

蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45OD280－0.74OD260 （此為經(jīng)驗(yàn)公式，即以不同濃度的蛋白質(zhì)和核酸混合測定的數(shù)值所建立的）。
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