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生物實(shí)驗中動物肝臟DNA的提取與純化的方法

閱讀:2947發(fā)布時間:2017-9-29

    生物體組織細(xì)胞中的大部分脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)與蛋白質(zhì)結(jié)合,以核蛋白——脫氧核糖核蛋白(DNP)和核糖核蛋白(RNP)的形式存在,這兩類中復(fù)合物再不同的電解質(zhì)溶液中的溶解度有較大差異。在低濃度的NaCl溶液中,DNP的溶解度隨NaCl濃度的增加而逐漸降低,當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.14mol/L時,DNP的溶解度約為純水中溶解度的1%(幾乎不溶);但當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)升高時,DNP的溶解度又逐漸增大,當(dāng)NaCl濃度增至0.5mol/L時,DNP的溶解度約為純水中溶解度的2倍(溶解度很大)。而RNP則不一樣,它在弄NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此,可以利用不同濃度的NaCl溶液將DNP和RNP分別抽提出來。

方法

1、DNA的提?。?/span>

a.稱取新鮮動物的肝臟(如豬肝)約10g,于研缽中,在冰浴中剪碎,加2倍組織重的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液(約20ml)研磨成漿狀,得勻漿液。

b.將勻漿液(除去組織碎片)于3000r/min離心10分鐘,棄去上清液,收集沉淀(內(nèi)含DNP),沉淀中加兩倍體積的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液,攪勻,如前離心,重復(fù)洗滌2~3次。所得沉淀為DNP粗制品,移至燒杯中。

2、DNA的純化:

a.取粗品DNA,加入5μl RNA酶,用玻璃棒慢慢攪拌20分鐘。

b.向沉淀中加入冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液,使總體積達(dá)到20ml,在緩慢攪拌的同時滴加25%的SDS溶液1.5ml,邊加邊攪拌,此步驟使核酸與蛋白質(zhì)分離。

c.加入2mol/L NaCl溶液 5ml,使NaClzui終濃度為1mol/L,攪拌10分鐘(速度要慢)。溶液變得黏稠并略帶透明。

d.加入等體積的*/氯*/異戊醇混合液,于冰浴中攪拌20分鐘,3000r/min離心10分鐘。分層,上層為水相(含DNA鈉鹽),中層為變性的蛋白沉淀,下層為*/氯*/異戊醇混合液。

e.用吸管小心地吸取上層水相,棄去沉淀,再在相同條件下重復(fù)抽提2~3次。

f.取上清液放入干燥小燒杯中,加入2倍體積預(yù)冷的95%乙醇。加乙醇時,用滴管吸取乙醇,邊加邊用玻璃棒慢慢順一個方向在燒杯內(nèi)轉(zhuǎn)動,隨著乙醇的不斷加入可見溶液出現(xiàn)黏稠狀物質(zhì),并能逐步纏繞與玻璃棒上,此時玻璃棒攪動的目的在于把黏稠絲狀物纏在玻璃棒上,直至再無黏稠絲狀物出現(xiàn)為止。黏稠絲狀物即是DNA。

g.用2ml 80%乙醇洗滌沉淀物1次。

h.室溫干燥,直到附于玻璃棒的殘余液滴干凈。

i.用1~2ml TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

注意事項

1、選擇的實(shí)驗材料要新鮮,處理時間不宜過長。

2、提取和純化的DNA不純,加溶解液大少使?jié)舛冗^大,或者沉淀物太干燥,這些因素都會導(dǎo)致提取的DNA不易溶解。

3、*/氯*/異戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸取,表明含高濃度的DNA,可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。


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