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膠回收試劑盒的操作步驟

閱讀:453發(fā)布時(shí)間:2015-5-28

1. 配制瓊脂糖EB凝膠,電泳以分離DNA片段。任何類型或等級(jí)的瓊脂糖都可以使用。

我們強(qiáng)烈的推薦使用新鮮的TAE/TBE電泳緩沖液。不要重復(fù)使用電泳緩沖液,舊的電泳緩沖液PH會(huì)增加而降低DNA的回收產(chǎn)量;

2. 電泳足夠時(shí)間后,在紫外燈下小心地把所需的DNA的片段切下來(lái)。并盡量去除多余的凝膠。

注意:DNA在紫外燈下的曝光的時(shí)間不要超過(guò)30秒,同時(shí)在紫外燈下操作的時(shí)候一定要戴保護(hù)眼鏡。

3. 稱取空離心管的重量,切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量,求出凝膠塊的重量,近似地確定其體積。一般情況下,凝膠的密度為1g/ml,于是凝膠的體積與重量的關(guān)系可按下面換算:凝膠薄片的重量為0.2g 則其體積為0.2ml;加入等倍凝膠體積的Binding Buffer,把混合物置于55~65水浴中溫浴7min至凝膠*融化,其間每隔2-3分鐘混勻一次;

重要提醒:在凝膠*溶解之后,注意凝膠-Binding Buffer混合物的pH值。如果其pH值大于8的話,DNA的產(chǎn)量將大大減少。觀察混合物的顏色,如果是橙色或紅色,則要加入5μl 濃度為5 M,pH5.2的醋酸鈉,以調(diào)低其pH值。經(jīng)過(guò)這一調(diào)節(jié),該混合物的顏色將恢復(fù)為正常的淺黃色。一般情況下,使用新鮮的電泳緩沖液,凝膠-Binding buffer混合物的PH值的不會(huì)升高;

4. 轉(zhuǎn)移700μlDNA-瓊脂糖溶液到一個(gè)HiBindTM DNA柱子,并把柱子裝在一個(gè)干凈的2ml收集管內(nèi),室溫下,10,000×g離心1min,棄去液體。

一個(gè)HiBind DNA柱子zui多可容納700μl的溶液,如果DNA-瓊脂糖混合物的體積大于700μl,可先轉(zhuǎn)移700μl溶液至柱子,離心完后,將余下的溶液繼續(xù)加上柱子上。但是每一個(gè)HiBindTM柱子zui多可以結(jié)合25~30μg DNA。如果預(yù)期產(chǎn)量較大,則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱中。

5. 將柱子重新套回收集管中,加300μl Binding BufferHiBind DNA 柱子中;室溫下,10,000×g離心 1分鐘,去棄濾出液;這一步相當(dāng)關(guān)鍵,不要忽略此步。

6. 將柱子重新套回收集管中,加入700μl SPW Wash bufferHiBind DNA柱子中,室溫下,10,000×g離心1分鐘,去棄濾出液;注:SPW Wash buffer在使用前必須按瓶子標(biāo)鑒要求用無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋。

7. 將柱子重新套回收集管中,重復(fù)加入700μl SPW Wash bufferHiBind DNA柱子中,室溫下,10,000×g離心1分鐘,去棄濾出液;

8. 棄去液體,將空柱子重新套回收集管中,10,000×g離心1min以甩干柱基質(zhì)殘余的液體。

這步可以去除柱子基質(zhì)上殘余的乙醇,不要省略此步―――對(duì)得到好的DNA產(chǎn)量是十分重要的。

9. 把柱子裝在一個(gè)干凈的1.5ml離心管上,加入30~50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上,10,000×g離心1分鐘,離心管中的溶液就是純化的DNA產(chǎn)物,保存于-20度。

如果再洗脫一次的話可以把殘余的DNA洗脫出來(lái),不過(guò)那樣的濃度就會(huì)較低。

DNA的產(chǎn)量及質(zhì)量:

把純化產(chǎn)物的樣品稀釋一定的倍數(shù)后,分別在260nm280nm下測(cè)其光吸收值,回收得到的DNA的濃度可按以下公式來(lái)計(jì)算: DNA濃度=光吸收260×50×稀釋倍數(shù)μg/ml

長(zhǎng)度大于500bp的片段通常能純化得到80%的產(chǎn)量。 50bp~500bp的帶則可達(dá)到55%~80%的回收率。(光吸收260/光吸收280)的比率是核酸純度的一個(gè)標(biāo)記。如果此值1.8,則意味著核酸的純度>90%。另一方面,如果純化產(chǎn)物的產(chǎn)量較低時(shí),可以用瓊脂糖EB電泳估算產(chǎn)物的濃度。


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