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北京低* 高品質(zhì) * HiSpeed Plasmid Maxi Kit (10)

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更新時(shí)間:2022-08-03 13:42:16瀏覽次數(shù):579次

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北京低* 高品質(zhì) * HiSpeed Plasmid Maxi Kit (10)

 北京低*  高品質(zhì) * HiSpeed Plasmid Maxi Kit (10) 

性能

EndoFree Plasmid Giga Kit將高效的內(nèi)毒素去除步驟整合到質(zhì)粒純化流程中,不需要額外步驟,也不需用親和柱去除脂多糖。通過(guò)QIAfilter Mega-Giga Cartridge過(guò)濾細(xì)菌裂解液,并使用重力流QIAGEN-tip 10000陰離子交換柱純化質(zhì)粒DNA。2.5升培養(yǎng)菌液zui多可純化10 mg DNA。純化的DNA無(wú)內(nèi)毒素(<0.1 EU/µg DNA)。

選用EndoFree Plasmid Mega Kit而非EndoFree Plasmid Giga Kit純化低拷貝質(zhì)粒和科斯質(zhì)粒,將會(huì)得到更好的效果,因?yàn)楹笳咝枰^大的培養(yǎng)體積,而QIAfilter Mega-Giga Cartridge的容量有限。

EndoFree Plasmid Kits去除細(xì)菌在裂解過(guò)程中釋放的內(nèi)毒素,內(nèi)毒素會(huì)影響原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染。從EndoFree Plasmid Kits得到的無(wú)內(nèi)毒素DNA高度適用于可重復(fù)且結(jié)果可靠的轉(zhuǎn)染(參見(jiàn)Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency及表"Endotoxin levels in plasmid preparations"和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells")。QIAGEN超純無(wú)內(nèi)毒素DNA也適用于基因治療研究和其他敏感應(yīng)用。

 
質(zhì)粒制備中的內(nèi)毒素水平*
質(zhì)粒制備方法 內(nèi)毒素(EU/µg DNA) 平均轉(zhuǎn)染效率
EndoFree Plasmid Kit 0.1 154%
QIAGEN Plasmid Kit 9.3 *
2x CsCl 2.6 99%
Silica-gel slurry 1230.0 24%
* 宿主菌:大腸桿菌DH5α  質(zhì)粒:pRSVcat。
† 1  ng LPS = 1.8 EU。 
 根據(jù)表中數(shù)據(jù)計(jì)算 Plasmid purification method versus transfection efficiency。
無(wú)內(nèi)毒素DNA轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞的高轉(zhuǎn)染率*
DNA純化方法 轉(zhuǎn)染細(xì)胞比例
EndoFree Plasmid Kit 21.0% ± 0.93
QIAGEN Plasmid Kit 8.1% ± 0.57
Silica-gel slurry 5.2% ± 0.74
* 原代兔胃壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N2(CLONTECH),pEGFP-N2由所示的方法制備。使用Effectene Transfection Reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染。該數(shù)據(jù)是細(xì)胞表達(dá)GFP的百分率,由轉(zhuǎn)染48小時(shí)后綠色熒光細(xì)胞數(shù)量確定。轉(zhuǎn)染效率是每種純化方法制備的超過(guò)2個(gè)不同的DNA中6–9個(gè)復(fù)制樣本的平均值。(數(shù)據(jù)由C. Chew and J. Parente提供,Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.)
原理

純化的質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素污染水平取決于所用的純化方法(參見(jiàn)"Endotoxin levels in plasmid preparations")。硅膠技術(shù)純化的DNA具有非常高的內(nèi)毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和兩次CsCl超速離心可獲得相對(duì)低水平內(nèi)毒素的純DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的內(nèi)毒素去除步驟,獲得<0.1 EU/µg的質(zhì)粒DNA。

QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊設(shè)計(jì)的過(guò)濾裝置,用于代替細(xì)菌細(xì)胞堿裂解后的離心步驟。QIAfilter Cartridges可*去除SDS沉淀,清除細(xì)菌裂解液,相比離心可大量節(jié)約時(shí)間,減少1小時(shí)的質(zhì)粒純化時(shí)間。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用內(nèi)部真空方式輕松高效的清除大量細(xì)菌裂解液(注意:該試劑盒不包含瓶子)。

QIAGEN-tips中*的陰離子交換樹(shù)脂(不提供EndoFree Plasmid Buffer Set)專(zhuān)為核酸純化而開(kāi)發(fā)。它的分離性能使得DNA純度與連續(xù)兩次CsCl梯度離心獲得的DNA純度相當(dāng)。由重力流驅(qū)動(dòng)并持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的預(yù)裝QIAGEN-tips,zui大限度減少手動(dòng)制備質(zhì)粒所需的時(shí)間。整個(gè)QIAGEN質(zhì)粒純化系統(tǒng)不使用有毒物質(zhì),如*,氯仿,溴化乙錠和CsCl,zui大限度地減少對(duì)用戶(hù)和環(huán)境的危害。

內(nèi)毒素,又稱(chēng)脂多糖或LPS,是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的組成部分,如大腸桿菌(參見(jiàn)Bacterial cell wall)。內(nèi)毒素在質(zhì)粒裂解純化過(guò)程中釋放出來(lái),并顯著降低內(nèi)毒素敏感細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率(參見(jiàn)Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency及表"Endotoxin levels in plasmid preparations"和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells")。此外,內(nèi)毒素與DNA競(jìng)爭(zhēng)“自由”轉(zhuǎn)染試劑,影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒DNA的攝取。內(nèi)毒素也誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)生非特異性免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染結(jié)果的誤讀。這些反應(yīng)包括誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)和脂類(lèi),如IL-1和前列腺素等的合成??傮w而言,內(nèi)毒素在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中是不可控變量,影響結(jié)果的可重復(fù)性,使它們難以對(duì)比、解讀。在基因治療研究中,內(nèi)毒素可造成內(nèi)毒素休克綜合癥和激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián),干擾研究。

操作流程

在堿性條件下,細(xì)菌細(xì)胞裂解,使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。將Endotoxin Removal Buffer加入到過(guò)濾后的裂解液中。冰浴后,將純凈的裂解物上樣到陰離子交換柱上,在適當(dāng)?shù)牡望}和pH條件下,質(zhì)粒DNA選擇性結(jié)合。用中鹽緩沖液清除RNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他低分子量雜質(zhì),超純質(zhì)粒DNA被高鹽緩沖液洗脫(參見(jiàn)QIAGEN Plasmid Kit procedures)。zui后DNA由異丙醇脫鹽、沉淀并且離心回收。

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