ELISA測定錯誤結(jié)果的原因分析

   ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗，是一種常用的固相酶免疫測定方法。Engvall 和Perlmann于1971年zui先應(yīng)用該法進(jìn)行了IgG定量測定，并命名為"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。 ELISA的基本原理是：
①使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性；
②使抗原（或抗體）與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原（或抗體），而且此酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；
③測定時將受檢標(biāo)本（抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原（或抗體）按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)，再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開，zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的抗體或抗原量成一定比例；再加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)其顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析，以了解被測標(biāo)本中抗體或抗原含量。 
    elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在臨床檢驗中除正常反應(yīng)外，有時常可見到一些錯誤結(jié)果（即假陽性或假陰性結(jié)果）。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有：
①標(biāo)本因素；
②試劑因素；
③操作因素。
本文就標(biāo)本因素對ELISA測定的影響做如下討論。 
    血清是zui常用的ELISA標(biāo)本，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：
1． 內(nèi)源性物質(zhì) 有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。 
（1）類風(fēng)濕因子 
人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子（RF）可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性。
解決該情況的辦法是：
①用F(ab)2替代完整的IgG；
②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性（63℃，10 min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）；③檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。 
（2）補體 ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補體C1q分子結(jié)合位點被暴露出來，使C1q 可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。 
（3）嗜異性抗體 人類血清中含有能與嚙齒類動物（如鼠等）Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig (s) ，但加入量不足或亞類不同時無效。 
（4）嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結(jié)果。為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測定前需用理化方法將其解離后再測定。 
（5）醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s) 抗體 臨床開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使這些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig (s) 抗體。這些病人ELISA測定時均可產(chǎn)生假陽性。解決的辦法是：測定抗原時，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig (s) ，從而克服由于上述原因造成的假陽性。 
（6）交叉反應(yīng)物質(zhì) 類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測定抗原時，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應(yīng)的靶決定簇時，也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 
（7）標(biāo)本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過高、*、血紅蛋白及血液粘度過大等，均對ELISA測定結(jié)果有干擾作用。 
2． 外源性物質(zhì) 
外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過久、標(biāo)本凝集不全和*中添加物等影響。 
（1）標(biāo)本溶血 由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測定中，會導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時必須注意避免溶血。 
（2）標(biāo)本受細(xì)菌污染 因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。 
（3）標(biāo)本保存不當(dāng) 在冰箱中保存過久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深、甚至造成假陽性；標(biāo)本放置時間過長（如一天以上），有時抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測定，但混勻時應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。 
（4）標(biāo)本凝集不全 在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h*凝固。臨床檢驗工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強(qiáng)行離心分離血清，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；這類情況于次日復(fù)查時因血凝已*，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮?。為避免上述干擾作用，解決的辦法是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時用帶分離膠的*或于*中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?nbsp;
（5）標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響 抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性）及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定干擾作用。 綜上所述，對臨床檢驗ELISA測定中出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果，在考慮試劑因素和操作因素之外，更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分析，并應(yīng)采取相應(yīng)措施排除干擾作用，從而為臨床提供正確可靠的檢測結(jié)果。