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上海哈靈生物科技有限公司
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土壤脫氫酶試劑盒操作方式
2021-5-4 閱讀(549)
土壤脫氫酶（Soil dehydrogenase, sDHA）試劑盒說明書
（分光光度法 50 管/48 樣）
注意：正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
土壤脫氫酶(Soil dehydrogenase, sDHA)的活性可以反映土壤體系內(nèi)活性微生物量以及其對有機(jī)物的降解活性，可以作為土壤微生物的降解性能指標(biāo)。
測定原理：
氫受體 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在細(xì)胞呼吸過程中接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF 呈現(xiàn)紅色，在波長 485nm 處有大吸收峰，采用分光光度法于 485nm 測定其吸光值，即得土壤脫氫酶活性。
自備實(shí)驗(yàn)儀器及用品：
篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、玻璃比色皿，冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請用戶自備）。
試劑的組成和配制：
試劑一：粉劑×1 瓶，使用前加 10mL試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）。
試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：自備甲醇。
試劑四：200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液1mL×1 支，4℃避光保存。
樣品處理：
新鮮土樣自然風(fēng)干或者37℃烘箱烘干，過30-50目篩
測定步驟和操作表：
測定管 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管
土樣（g） 0.1
標(biāo)準(zhǔn)液（μL） 200
試劑一應(yīng)用液（μL） 200 200
試劑二（μL） 200
充分混勻，37℃，暗培養(yǎng) 24h（標(biāo)準(zhǔn)管無需反應(yīng)24h，可在測定、空白管暗培養(yǎng)24h后再測）
甲醇（μL） 1800 1800 1600
避光反復(fù)震蕩1小時(shí)，8000g，離心 5min，取上清 1mL 于 1mL光徑玻璃比色皿，測定A485。空白只要做1管。
（標(biāo)準(zhǔn)管用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，參考附錄I）
酶活單位定義：在 37℃時(shí)，每克土壤樣品每天催化產(chǎn)生 1μg TF 為一個(gè)酶活性單位。
脫氫酶活力計(jì)算：
注意事項(xiàng)：
1. 配制好的試劑一避光保存于 4℃，在一周內(nèi)使用，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。
2. 試劑三易揮發(fā)，有毒，為了您的健康，請穿實(shí)驗(yàn)服，戴，戴乳膠手套操作。
附錄I：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
一、操作表：
標(biāo)準(zhǔn)管 S0 S1 S2 S3 S4
200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液（μL） 0 50 100 150 200
試劑二（μL） 200 200 200 200 200
甲醇（μL） 1800 1750 1700 1650 1600
避光反復(fù)震蕩1小時(shí)，1mL光徑玻璃比色皿，測定A485
相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)液濃度（μg/L） 0 5 10 15 20
注：標(biāo)準(zhǔn)液初始濃度為200μg/mL，因其為主要呈色物質(zhì)，體系中的其他試劑只是對其起到了稀釋作用，故終反應(yīng)完反應(yīng)液中標(biāo)準(zhǔn)濃度為（200μg/mL÷（各管反應(yīng)體系總體積÷各管加入200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液體積））。
二、結(jié)果：
標(biāo)準(zhǔn)管號 S0 S1 S2 S3 S4
OD值 0.005 0.238 0.473 0.69 0.952
OD值 0 0.233 0.468 0.685 0.947
相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)液濃度（μg/L） 0 5 10 15 20
