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ELISA原理酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的四種方法
2013-8-29 閱讀(1032)
ELISA原理酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定
抗體或抗原可以吸附在合適的載體上，酶標(biāo)記抗體或抗原相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標(biāo)記的抗原抗體免疫復(fù)合物，在一定量底物的參與下，酶催化底物在復(fù)合物上水解，氧化或還原成為另一種帶色的物質(zhì)。因?yàn)樵谔囟ǖ臈l件下，酶的降解底物和出現(xiàn)光彩是成正比的，所以可以應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出到場(chǎng)反應(yīng)的抗原和抗體的含量。這便是Peter Perlmann 和Eva Engvall所創(chuàng)建的ELISA技術(shù)的原理。
根據(jù)所用固相載體的區(qū)別，ELISA又分為普通ELISA和Dot-ELISA。
按照抗體或抗原在固相載體上不同的吸附方式，又根據(jù)使用不同的抗體比如能與抗原直接發(fā)生反應(yīng)的抗體（通常稱(chēng)為一抗），能與一抗起免疫聯(lián)合反應(yīng)的標(biāo)有酶的抗體（通常稱(chēng)為酶標(biāo)二抗），ELISA分解出多項(xiàng)不同測(cè)定方式。
ELISA一樣通常分為一下幾種類(lèi)型：
（1）直接法：起首將抗原吸附于載體外貌，然后將酶標(biāo)記抗體與該抗原反應(yīng)結(jié)合，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，zui后參加底物產(chǎn)生有色的物質(zhì)，進(jìn)行光密度測(cè)定，算出抗體存在量。
（2）間接法：首先將抗原吸附于載體表面，然后加抗血清，使特異性抗體（*抗體）與抗原結(jié)合，再加酶標(biāo)記抗球卵白（第二抗體，即抗*抗體的抗體），與*抗體結(jié)合，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，zui后加入底物產(chǎn)生有色的物質(zhì)，進(jìn)行光密度測(cè)定，算出抗體存在量。
（3）雙重抗體法：首先將抗體吸附于載體表面，形成抗體球卵白致敏載體表面，然后加抗原溶液，使抗原與抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)志的抗體球卵白，與被致敏載體表面吸附的抗原結(jié)合，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，zui后加入底物產(chǎn)生有色的物質(zhì)，進(jìn)行光密度測(cè)定，算出抗原存在量。ELISA雙重抗體法也稱(chēng)ELISA雙重抗體夾心法，此法能削弱非特異顏色的干擾，而且在測(cè)定時(shí)可不做空白比較。
（4）酶標(biāo)志抗原競(jìng)爭(zhēng)法：首先將抗體吸附于載體表面，形成抗體球卵白的致敏載體表面，然后加入以不一樣比例混合的抗原和酶標(biāo)記的抗原溶液，與吸附在載體上的抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，形成酶標(biāo)記抗原與抗體的免疫復(fù)合物和非標(biāo)記抗原與抗體的免疫復(fù)合物，zui后加入底物，通過(guò)酶的底物水解量（測(cè)定光密度而知）來(lái)確定未知溶液有無(wú)抗原及抗原量數(shù)量。
酶標(biāo)志抗原競(jìng)爭(zhēng)法利用混合的未標(biāo)記的抗原和酶標(biāo)志抗原相互競(jìng)爭(zhēng)抗體上的結(jié)合點(diǎn)，從而進(jìn)行抗原的定量。未標(biāo)記的抗原的量越大，則酶標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制。但是競(jìng)爭(zhēng)法在實(shí)行時(shí)比較繁瑣，有時(shí)候在抗原混合液與相應(yīng)抗體孵育后，在測(cè)定游離抗原與抗體相結(jié)合抗原的活性以前，要行鹽析或有機(jī)溶劑沉淀或第二抗體沉淀等方式把兩種不同存在形態(tài)的抗原分開(kāi)。而且在參加底物后，容易產(chǎn)生血清色的物質(zhì)。因此，每次測(cè)定時(shí)都需做空白對(duì)照。因?yàn)檫@些缺點(diǎn)，酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法很少使用。
