美國華盛頓大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員對蛋白降解過程中磷酸化與泛素化的交互應(yīng)答進(jìn)行了整體分析，發(fā)現(xiàn)不同的磷酸化位點(diǎn)往往同時(shí)發(fā)生泛素化。這項(xiàng)研究成果于近期在線發(fā)表在《Nature Methods》雜志上。
蛋白的翻譯后修飾（PTM）功能作為高度靈活的開關(guān)，調(diào)控著蛋白活性、濃度以及亞細(xì)胞定位。蛋白的一個或多個殘基可被修飾，賦予特定的蛋白調(diào)控。然而，蛋白的翻譯后修飾存在交互應(yīng)答（cross-talk），即一種修飾的存在會影響其他的出現(xiàn)，這種現(xiàn)象的基礎(chǔ)仍然不明。
真核生物蛋白質(zhì)組中存在兩種zui普遍的翻譯后修飾，磷酸化和泛素化，它們在幾乎每個細(xì)胞過程中都是*的。磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要機(jī)制，而泛素化在蛋白降解中發(fā)揮了重要的作用。磷酸化和泛素化之間的交叉調(diào)控可采取很多形式。
然而，到目前為止，大部分研究都只關(guān)注一種類型的修飾，這主要是鑒于兩方面的限制。首先，修飾往往以低于化學(xué)計(jì)量的水平存在，需要高度特異的富集方法。其次，蛋白質(zhì)組學(xué)通常在肽段上開展，而不是完整的蛋白，這種實(shí)驗(yàn)通常切斷了單個蛋白異形體上多種修飾之間的關(guān)聯(lián)。為此，華盛頓大學(xué)基因組科學(xué)系的Danielle Swaney等研究人員開發(fā)出兩種富集策略，實(shí)現(xiàn)了共修飾蛋白的整體鑒定，并應(yīng)用這些方法來研究蛋白降解背景下泛素化與磷酸化之間的交互應(yīng)答。
在*種富集方法中，研究人員應(yīng)用鈷-NTA親和純化來富集釀酒酵母中經(jīng)泛素（帶His標(biāo)簽）修飾的蛋白。這種泛素富集后的群體稱為泛素化蛋白，而穿流液則被稱為未泛素化的蛋白。經(jīng)過*消化后，他們富集了這兩部分蛋白中的磷酸化肽段。此外，為了鑒定泛素化蛋白中的單個泛素化位點(diǎn)，他們使用抗體來富集消化后泛素化的賴氨酸殘基上仍存在*-*（diGly）的肽段。之后，他們利用納米反向液相色譜（nRPLC）偶聯(lián)串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）來分析這三種樣品（未泛素化的磷酸化肽段、泛素化的磷酸化肽段以及泛素化的未磷酸化肽段）。第二種方法則是直接鑒定同時(shí)存在磷酸化和泛素化修飾的肽段。研究人員首先用*將蛋白消化成肽段，隨后利用強(qiáng)陽離子交換（SCX）層析來富集帶雙電荷的肽段。之后通過抗體對SCX組分進(jìn)行進(jìn)一步富集，并通過nRPLC偶聯(lián)MS/MS分析。
通過這兩種方法，研究人員鑒定出466個同時(shí)經(jīng)泛素化和磷酸化修飾的蛋白。此外，他們應(yīng)用這些方法來定量鑒定通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控蛋白降解的磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果表明，不同的磷酸化位點(diǎn)通常也用于泛素化，且這些位點(diǎn)在整個磷酸化位點(diǎn)中更高度保守。zui后，研究人員還探討了磷酸化機(jī)制如何被泛素化所調(diào)控。
作者認(rèn)為，翻譯后修飾的交互應(yīng)答是一個復(fù)雜且多層面的問題，且大部分還有待探索。而一些新的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比如他們所使用的，如今提供了一種實(shí)用的方法，來鑒定修飾交互應(yīng)答，并闡明其復(fù)雜性和影響力。
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