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閱讀:1445發(fā)布時間:2013-12-9
隨著大家對單細胞轉錄組分析的興趣日益增加,開展單細胞RNA-seq的方法也在不斷涌現(xiàn)。近日,斯坦福大學的研究人員比較了市場上各種單細胞RNA擴增方法,以系統(tǒng)評估單細胞RNA-seq方法的靈敏度和準確性。他們的研究結果發(fā)表在《Nature Methods》在線版上。
目前,整個轉錄組的高通量測序(RNA-seq)已廣泛用于各種組織的基因表達分析。然而,人們開展單細胞轉錄組分析的愿望也越來越強烈,這是因為有些細胞量少珍貴,不足以開展傳統(tǒng)的RNA-seq,也有人希望對異質群體中的細胞亞群開展分析。過去的基因表達“平均值”已不再能滿足人們的需求。
近年來,開展單細胞RNA-seq的各種方法時有報道,但關于這些方法的通量和性能還存在一些問題。比如說,性能主要是通過靈敏度和性來評估的。然而,為了評估測定方法的有效性,還應當評估準確性,即測量值與真實值之間有多接近。
為此,斯坦福大學生物工程系的Stephen R Quake領導的研究小組對102個人類單細胞轉錄組進行了定量的RNA-seq分析。他們采用了三種單細胞RNA擴增方法,分別為SMARTer Ultra Low RNA Kit(Clontech)、TransPlex Kit(Sigma-Aldrich)以及利用C1微流體系統(tǒng)(Fluidigm)進行SMARTer cDNA合成。同時,他們也利用大量總RNA開展傳統(tǒng)的RNA-seq,并通過多重qPCR對同一細胞類型中的40個基因進行獨立定量,來評估單細胞方法的準確性。
由于很難獲得表達水平,研究人員計算了每種細胞的相對表達水平,即相對所有轉錄本中位數(shù)表達的基因表達。所產(chǎn)生的無量綱數(shù)應獨立于測定方法,可直接比較,以確定方法的準確性。他們發(fā)現(xiàn),對于單細胞方法,qPCR和RNA-seq的表達值相關性良好(r > 0.84),證實了單細胞RNA-seq方法能夠以定量的方式檢測基因表達,與目前的金標準qPCR方法一致。
有趣的是,各種方法之間的相關系數(shù)和線性回歸的斜率不同。相關系數(shù)表示每種方法能夠在多大程度上再現(xiàn)qPCR所測定的表達,而斜率表示一些失真。他們發(fā)現(xiàn),以納升體積開展樣品制備(C1系統(tǒng))產(chǎn)生了幾乎為1的回歸斜率,表明準確性zui高。一種可能的解釋是,減小反應室的體積可增大反應物的有效濃度,減少模板與非特異分子之間的競爭,從而減少擴增偏向。
此外,研究人員還直接比較了微升和納升級的樣品制備,發(fā)現(xiàn)對于qPCR和RNA-seq,以納升體積制備的樣品都產(chǎn)生了更少的假陽性。作者認為,與管式的樣品制備相比,C1平臺表現(xiàn)出一些優(yōu)勢,包括假陽性低和偏向小。
作者總結道,他們的結果表明,單細胞RNA-seq可產(chǎn)生與qPCR相當?shù)慕Y果,特別是在以納升反應體積制備樣品時(如微流體裝置C1)。通常在樣品制備過程中引入的偏向減小,而相關性也進一步提高。他們希望,低偏向、高通量的單細胞RNA-seq將讓原代組織的研究變得常規(guī)。(
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