如今，單細(xì)胞基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究不再是遙不可及。利用新興的微流體方法和分子生物學(xué)技術(shù)，研究人員逐漸能從群體噪音中提取單細(xì)胞信號?！禛enome Technology》雜志請來了一些專家，來分享他們在單細(xì)胞qPCR分析上的經(jīng)驗。通過一問一答的形式，希望能為您的研究帶來一點啟發(fā)。
Q5：您如何定量單細(xì)胞qPCR結(jié)果？
Mikael Kubista（TATAA生物中心）
單細(xì)胞表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析包括三個步驟：normalization、scaling和clustering。用參考基因的表達(dá)來均一化（normalization）不適用于單細(xì)胞，因為基因表達(dá)存在大的、不相關(guān)的變化。我們在原先的文章中展示了這一點，自那以后，幾乎所有的基因和細(xì)胞都證明了這一點，除了mRNA代謝不活躍的細(xì)胞（如卵母細(xì)胞）外。更好的做法是均一化每個細(xì)胞的表達(dá)，也就是直接比較測得的量。這是zui直觀的。當(dāng)然，這種方法不能說明樣品處理過程中的損失，但我們發(fā)現(xiàn)那通?？珊雎圆挥?。如果您擔(dān)心樣品處理，那么上面提到的RNA加標(biāo)可用于測定產(chǎn)量和重復(fù)性。
對于表達(dá)譜分析，數(shù)據(jù)可以多種方法進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)可能是unscaled、mean-centered或autoscaled。Mean centering（減去平均值）和autoscaling（減去平均值并除以標(biāo)準(zhǔn)偏差）可平衡分析中標(biāo)志物的權(quán)重。對于單細(xì)胞，我們有時候也覺得Mean centering和autoscaling很有用。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學(xué)）
如果避免了預(yù)擴增，數(shù)據(jù)可轉(zhuǎn)換成的cDNA數(shù)量，否則數(shù)據(jù)分析可以Cq值來開展，因為每個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本水平呈對數(shù)正態(tài)分布。一開始，可以各種方法對數(shù)據(jù)作圖，此外，基本的統(tǒng)計分析也應(yīng)開展（如陽性細(xì)胞的數(shù)量、平均值和偏差）。細(xì)胞數(shù)量測定通常是以驗證過的參考基因來均一化的。這種策略在單細(xì)胞分析中應(yīng)避免，因為單個細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄本水平隨時間變化。我們發(fā)現(xiàn)，校正分析和無監(jiān)督算法（如Kohonen self-organizing maps）對定義亞群和基因網(wǎng)絡(luò)很有用。
Finn-Arne Weltzien（挪威獸醫(yī)學(xué)院）
我們在利用單細(xì)胞qPCR進(jìn)行定量測定時很小心。我們通常只進(jìn)行定性分析。如果我們定量，我們會利用目的基因的拷貝數(shù)相對參考基因的拷貝數(shù)。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學(xué)，現(xiàn)在天津大學(xué)）
對于每個單細(xì)胞，我們對目的基因和參考基因進(jìn)行qPCR分析，如原核生物的16s rRNA和真核生物的28s或actin。不過，我們也注意到，這些常用參考基因的表達(dá)水平在單細(xì)胞中也差別很大，對大量細(xì)胞qPCR的標(biāo)準(zhǔn)定量法則也須特別謹(jǐn)慎。在大部分情況下，我們報告原始和均一化的Ct值，并使用它們進(jìn)行單細(xì)胞qPCR結(jié)果的定量。
Q6：您分析時使用哪些生物信息學(xué)工具？
Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我們采用GenEx進(jìn)行單細(xì)胞分析。事實上，我們在所有qPCR數(shù)據(jù)分析中使用GenEx。GenEx強大、用戶友好，且支持所有的qPCR儀器，這讓從實驗中導(dǎo)入數(shù)據(jù)和注釋很簡單。GenEx有著的數(shù)據(jù)質(zhì)量評估，對單細(xì)胞研究很重要，以及強大的單細(xì)胞表達(dá)譜工具。它有著用戶友好的界面，即使是沒有經(jīng)驗的用戶也能使用那些強大的工具。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學(xué)）
我使用GenEx和SPSS開展數(shù)據(jù)分析。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學(xué)，現(xiàn)在天津大學(xué)）
對于幾十個基因的分析，我們采用ANOVA student t-test或其他簡單的統(tǒng)計學(xué)工具。不過，如果以擴增的單細(xì)胞cDNA作為模板，分析幾千個基因，則可能需要更*的生物信息學(xué)工具。
