*福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片的存檔代表了珍貴且來源廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究材料。隨著越來越多的研究人員轉(zhuǎn)向FFPE樣品的分子分析，開發(fā)特定的操作步驟，考慮這些樣品的*性質(zhì)就變得越來越重要。成功的FFPE樣品分子分析的關(guān)鍵因素
如前文所述，福爾馬林固定和石蠟包埋會損害從組織樣品中獲得的核酸質(zhì)量。在本文中，我們解釋了FFPE樣品中的低質(zhì)量分析物將如何負(fù)面影響FFPE樣品的分子分析，并就克服這一挑戰(zhàn)提出了一些必要措施。
1 RNA質(zhì)量控制
在開展RNA樣品的質(zhì)量控制時，通常測定的參數(shù)包括260 nm和280 nm的吸光度比值（對于10 mM Tris•Cl，pH 7.5中的純RNA，A260/A280比值在1.9-2.1）以及28S rRNA與18S rRNA的比值（2:1的比值意味著完整RNA）。通過毛細(xì)管電泳（如QIAxcel® System）分析RNA樣品，可指示RNA的片段化狀態(tài)（圖17）。QIAxcel實(shí)現(xiàn)了zui多96個RNA FFPE樣品的分析，而無需人工干預(yù)。它的分析比其他質(zhì)量控制系統(tǒng)更快，操作也更簡單，因?yàn)樗褂眉从眯偷哪z卡夾。
圖17. 來自FFPE樣品的RNA的質(zhì)量控制分析。大鼠腎臟樣品經(jīng)過福爾馬林固定和石蠟包埋。在包埋后立即切片（上圖），或保存12個月后再切片（下圖）。利用RNeasy FFPE Kit純化總RNA。純化后的RNA在A QIAxcel或B Agilent 2100 BioAnalyzer上分析。
Agilent 2100 Bioanalyzer等系統(tǒng)還產(chǎn)生RIN（RNA完整性系數(shù)）或類似值，從1到10。RIN值為10表明高度完整的RNA，而RIN值為1則表明高度片段化的RNA。盡管這些參數(shù)給出了RNA純度和完整性的概念，但沒有提供化學(xué)修飾方面的信息。如上文所述，福爾馬林固定引入了分子之間的交聯(lián)，而甲醛對RNA的修飾會損害下游的酶學(xué)分析，如RT-PCR（圖18）。
圖18. 福爾馬林固定和石蠟包埋對RT-PCR效率的影響。各種大鼠組織經(jīng)過福爾馬林固定和石蠟包埋。在包埋后3天（T0）或在4°C、20-25°C或37°C保存一年后，利用RNeasy FFPE Kit純化RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer上分析RNA完整性，RIN值如圖所示，電泳峰圖詳見圖4。純化后的RNA用于一步法RT-PCR，使用的是QIAGEN OneStep RT-PCR Kit和大鼠Hprt1基因的不同引物對，產(chǎn)生了128、208、404和669 nt的擴(kuò)增子。RT-PCR也利用新鮮組織的RNA開展，作為陽性對照，并開展無模板RT-PCR，作為陰性對照。結(jié)果表明，F(xiàn)FPE樣品中較長擴(kuò)增子的擴(kuò)增受損。此外，PCR表現(xiàn)與RNA完整性不相關(guān)。這是因?yàn)?，對于大部分樣品，甲醛對RNA的化學(xué)修飾是限制因素，而非RNA段長度。（數(shù)據(jù)引用自von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）。
因此，來自FFPE樣品的RNA質(zhì)量的評估應(yīng)包含一套RT-PCR分析，以確定擴(kuò)增子大小的上限。或者，對于oligo-dT靶定的cDNA，可利用不同引物對開展實(shí)時定量RT-PCR分析，以產(chǎn)生相似大小的擴(kuò)增子，它們距離RNA轉(zhuǎn)錄本的3’端越來越遠(yuǎn)。擴(kuò)增反應(yīng)的成功程度將指示整個轉(zhuǎn)錄本中RNA降解的程度。由于oligo-dT靶定不建議用于FFPE樣品的RNA，故*種方法是。
至于Agilent 2100 Bioanalyzer上高度片段化RNA樣品的分析，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，RIN值為4或以下不能提供太多信息或重復(fù)。對于高度降解的RNA，我們認(rèn)為，使用峰片段長度（它可從峰圖中推導(dǎo)出）作為RNA完整性的度量。
2 通過PCR和實(shí)時定量PCR開展DNA分析
正如前文所述，由于福爾馬林交聯(lián)的引入，F(xiàn)FPE樣品中的基因組DNA常常嚴(yán)重片段化并修飾。QIAamp DNA FFPE Tissue Kit對基因組DNA的純化確實(shí)會逆轉(zhuǎn)一些交聯(lián)，但其他交聯(lián)是不可逆轉(zhuǎn)的，在純化后仍然存在。因此，需要一個可靠的PCR系統(tǒng)，來擴(kuò)增這種困難的模板類型。既然只有一部分起始模板可以擴(kuò)增，那么PCR高靈敏度和特異性才是FFPE樣品成功檢測的前提。HotStarTaq® DNA Polymerase和HotStarTaq Plus DNA polymerase再加上QIAGEN*的PCR Buffer，為這種類型的起始模板提供了高度靈敏的PCR。此外，在開展FFPE樣品的基因組DNA的PCR或?qū)崟r定量PCR分析時，我們強(qiáng)烈建議設(shè)計(jì)盡可能短的擴(kuò)增子。
3 通過實(shí)時定量RT-PCR開展基因表達(dá)分析
基因表達(dá)的分析可通過實(shí)時定量RT-PCR來實(shí)現(xiàn)，其中從樣品中純化得到的RNA先通過逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)化成cDNA，之后可實(shí)時擴(kuò)增和檢測所需的cDNA目標(biāo)。
如果實(shí)時定量RT-PCR的引物能擴(kuò)增cDNA和基因組DNA序列，那么RNA樣品中基因組DNA污染的存在會影響基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。因此，必須避免基因組DNA污染，以保證準(zhǔn)確的結(jié)果。利用RNeasy FFPE Kit、miRNeasy FFPE Kit或AllPrep DNA/RNA FFPE Kit純化RNA，可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，它們包含了一個步驟，可從分離的RNA中去除痕量的小片段基因組DNA。此外，實(shí)時定量RT-PCR也可作為兩步法應(yīng)用開展，利用QuantiTect Reverse Transcription Kit進(jìn)行cDNA合成，接著利用QuantiFast PCR Kit進(jìn)行擴(kuò)增。在cDNA合成過程中，QuantiTect Reverse Transcription Kit通過新穎的gDNA Wipeout技術(shù)去除基因組DNA污染。另外，實(shí)時定量RT-PCR也可作為一步法應(yīng)用開展，使用QuantiFast® Probe RT-PCR Plus Kit，它在實(shí)時定量RT-PCR開始之前去除基因組DNA污染。有了QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit，所獲得的CT值明顯高于其他方法，那些方法依賴基因組DNA的含量和基因表達(dá)的水平。這并不是因?yàn)樵噭┖械腜CR靈敏度較低，而是它只檢測cDNA，而不是cDNA和基因組DNA（圖19）。
圖19. 基因組DNA的去除帶來準(zhǔn)確的基因表達(dá)分析。利用RNeasy FFPE Kit，從人的乳腺、肝臟或腎臟FFPE樣品中純化總RNA。對多個表達(dá)水平不同的不同目標(biāo)開展雙重、實(shí)時定量RT-PCR，帶有（+RT）或不帶（-RT）逆轉(zhuǎn)錄步驟，使用的是QuantiFast Probe Assays（FAM™標(biāo)記）和A QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit或B 另一個多重PCR試劑盒，不包含gDNA去除步驟。所有反應(yīng)在ABI StepOnePlus™循環(huán)儀上開展。A -RT樣品的高CT值表明無擴(kuò)增，且不存在基因組DNA污染。因此+RT樣品所獲得的CT值反映了可靠且準(zhǔn)確的RNA檢測。目標(biāo)12（TUSC2）和13（EZH2）不表達(dá)。這些結(jié)果表明，QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit有效去除了基因組DNA。B -RT和+RT樣品的CT值相似說明了基因組DNA污染可檢測到，讓這些結(jié)果不可靠。
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，zui常用的引物是隨機(jī)六聚體或oligo-dT引物。然而，這些引物并不適用于FFPE組織中化學(xué)修飾和片段化的RNA。使用oligo-dT引物時，逆轉(zhuǎn)錄從mRNA轉(zhuǎn)錄本的poly-A尾巴開始。因此，如果RNA嚴(yán)重片段化或被甲醛修飾，那么只有對應(yīng)于轉(zhuǎn)錄本3’端的cDNA才能合成。隨機(jī)六聚體更為合適，特別是對于表達(dá)譜研究（如芯片分析）。不過它們也有限制，特別是研究單個基因的表達(dá)時。只有與目的擴(kuò)增子相近的隨機(jī)六聚體才能產(chǎn)生實(shí)時定量PCR分析所需的cDNA目標(biāo)。由于這些六聚體只占逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中全部六聚體的一小部分，所以它們的起始效率非常低。
為了在實(shí)時定量RT-PCR中獲得*的結(jié)果，應(yīng)當(dāng)在逆轉(zhuǎn)錄步驟中使用與目的擴(kuò)增子相近的基因特異引物。或者，使用oligo-dT引物和隨機(jī)引物，如QuantiTect Reverse Transcription Kit一樣。此外，應(yīng)設(shè)計(jì)實(shí)時定量PCR步驟的引物，讓擴(kuò)增子盡可能短。如果選擇的擴(kuò)增子長于將要擴(kuò)增的RNA段，會導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。FFPE樣品中RNA段的大小通常在50-300 nt，大部分片段的大小在100 nt左右。QuantiFast Probe Assays是基于成熟的水解探針技術(shù)（5’ 核酸酶技術(shù)，如TaqMan®），利用算法而設(shè)計(jì)，通過探針型實(shí)時定量RT-PCR來實(shí)現(xiàn)FFPE樣品的基因表達(dá)分析。QuantiFast Probe Assays能夠擴(kuò)增和檢測不超過100 bp的RNA和cDNA目標(biāo)，效率和可靠性都很高（圖20）。
圖20. FFPE樣品中RNA的實(shí)時定量RT-PCR檢測。利用RNeasy FFPE Kit從乳腺組織FFPE樣品中純化得到總RNA（1 ng、100 pg、10 pg和1 pg）。在Rotor-Gene Q循環(huán)儀上擴(kuò)增和檢測人MUC1基因的轉(zhuǎn)錄本，利用的是QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit和QuantiFast Probe Assay（藍(lán)色曲線）或供應(yīng)商AII的預(yù)設(shè)計(jì)分析（紅色曲線）。與供應(yīng)商AII的分析相比，QuantiFast Probe Assay的結(jié)果表現(xiàn)出較低的CT值和更高的靈敏度。利用QuantiFast Probe Assay可檢測低至1 pg的模板（利用供應(yīng)商AII的分析無法檢測1 pg）。
FFPE樣品的珍貴性意味著只有少量RNA才能回收，這限制了實(shí)時定量RT-PCR分析的數(shù)量。在需要分析大量基因時，這可能是一個嚴(yán)重的問題。為了增加可供分析的cDNA量，可在逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時定量PCR之間引入一個預(yù)擴(kuò)增步驟。通過RT2 FFPE PreAMP技術(shù)，在cDNA合成之后開展多重PCR，預(yù)擴(kuò)增cDNA目標(biāo)，這些目標(biāo)來自特定通路或疾病狀態(tài)的基因。在預(yù)擴(kuò)增之后，利用適當(dāng)?shù)腞T2 Profiler PCR Array，每個cDNA目標(biāo)可通過實(shí)時定量PCR單獨(dú)定量（圖21）。RT2 FFPE PreAMP技術(shù)不僅提高實(shí)時定量PCR分析的靈敏度，還保留了原始的基因表達(dá)譜。
圖21. cDNA目標(biāo)預(yù)擴(kuò)增之后的芯片分析。利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit從人乳腺FFPE組織中純化總RNA。隨后利用RT2 FFPE PreAMP技術(shù)對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。利用Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Array通過實(shí)時定量PCR開展基因表達(dá)分析，比較一個腫瘤樣品和一個非腫瘤樣品。ΔΔCT分析表明，腫瘤樣品與非腫瘤樣品的基因表達(dá)相差x倍。
4 利用焦磷酸測序開展甲基化和突變分析
焦磷酸測序是一種新穎的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了核苷酸序列的可靠測序以及目的序列內(nèi)遺傳變異（如CpG位點(diǎn)的甲基化或突變）的靈敏、準(zhǔn)確定量（圖22和23）。由于FFPE樣品中的DNA分子互相交聯(lián)，并與其他分子交聯(lián)，那么在焦磷酸測序分析之前必須去除這些交聯(lián)。使用EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit（圖22）或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（圖23）從FFPE樣品中純化基因組DNA，可確保福爾馬林交聯(lián)的部分逆轉(zhuǎn)（一些交聯(lián)是不可逆的），為擴(kuò)增和隨后的焦磷酸測序分析提供了適當(dāng)?shù)腄NA模板。
圖22. 利用焦磷酸測序開展DNA甲基化分析。利用EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit從大鼠肝臟FFPE組織（10 μm）中純化DNA。利用PyroMark PCR Kit擴(kuò)增APC基因上的3個CpG位點(diǎn)，并利用PyroMark Gold Q24試劑開展焦磷酸測序分析。峰圖顯示了可靠的焦磷酸測序長讀取以及每個CpG位點(diǎn)甲基化水平的靈敏定量（藍(lán)色背景）。以黃色高亮顯示的位點(diǎn)是對照位點(diǎn)，證明了DNA的*亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。
圖23. 利用焦磷酸測序開展突變分析。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit從結(jié)腸癌FFPE組織中純化DNA。利用KRAS Pyro Kit開展焦磷酸測序，以便鑒定KRAS基因中的突變。A 一個密碼子12和13的基因型正常的樣品分析后的峰圖軌跡。B 一個密碼子12中第2位堿基發(fā)生GGT ? GAT突變的樣品分析后的峰圖軌跡
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