*福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片的存檔代表了珍貴且來(lái)源廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究材料。隨著越來(lái)越多的研究人員轉(zhuǎn)向FFPE樣品的分子分析，開(kāi)發(fā)特定的操作步驟，考慮這些樣品的*性質(zhì)就變得越來(lái)越重要。二、從FFPE樣品中提取有用分析物的的關(guān)鍵因素
從FFPE樣品中純化DNA、RNA和蛋白時(shí)，目前存在一些主要困難。首先，這些生物分子彼此交聯(lián)。交聯(lián)程度和不可逆交聯(lián)的比例取決于，或部分取決于，福爾馬林固定的持續(xù)時(shí)間。其次，核酸常常嚴(yán)重片段化，這取決于FFPE樣品如何制備和保存。第三，由于FFPE樣品很珍貴，故只有有限的材料可用于分析物純化和下游分析。因此，所用的純化步驟必須是的，盡可能多地回收有用的分析物。本章介紹了從FFPE樣品中純化DNA、RNA和蛋白的*挑戰(zhàn)，以及如何zui有效地克服它們。
5 總RNA和miRNA的純化
甲醛修飾會(huì)影響FFPE樣品中的DNA，這個(gè)問(wèn)題也同樣適用于RNA。全新經(jīng)過(guò)優(yōu)化的RNeasy FFPE Kit和miRNeasy FFPE Kit都是專(zhuān)門(mén)為FFPE樣品的RNA純化而設(shè)計(jì)的（圖11和12）。由于RNA在熱處理時(shí)更容易片段化，故試劑盒使用了經(jīng)過(guò)優(yōu)化的緩沖液條件，并降低了孵育溫度。盡管80°C以上的孵育會(huì)略微改善RNA在RT-PCR中的表現(xiàn)，但它還是會(huì)導(dǎo)致更多RNA片段化。同時(shí)，在較低溫度下孵育會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量較低，且RT-PCR表現(xiàn)明顯變差。
FFPE樣品先用蛋白酶K在56°C消化15分鐘，以便從交聯(lián)的蛋白分子中釋放RNA分子，之后在80°C孵育15分鐘，以逆轉(zhuǎn)一些甲醛修飾。接著，為避免DNA污染，特別是去除有可能干擾下游分析（如實(shí)時(shí)定量RT-PCR）的痕量DNA小片段，用DNase Booster和DNase處理RNA。在接下來(lái)的步驟中，利用RNeasy MinElute離心柱純化RNA，其中RNA經(jīng)過(guò)結(jié)合、洗滌，zui終洗脫在15-30 μl無(wú)RNase的水中。取決于結(jié)合條件，低至70 nt的總RNA（RNeasy FFPE Kit）或包含低至18 nt的miRNA的總RNA（miRNeasy FFPE Kit）被純化。鑒于RNA的片段化性質(zhì)，嘗試純化單獨(dú)的、富含小RNA的部分是不切實(shí)際的。為了提高標(biāo)準(zhǔn)化和便利性，RNeasy FFPE Kit和miRNeasy FFPE Kit所開(kāi)展的RNA純化必要時(shí)也可在QIAcube上自動(dòng)開(kāi)展。
圖11. 來(lái)自FFPE樣品的RNA的實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析。利用RNeasy FFPE Kit從大鼠腎臟中純化總RNA。在Rotor-Gene® Q循環(huán)儀上開(kāi)展PGK1（磷酸甘油酸激酶1）的實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析，加（+RT）或不加（-RT）逆轉(zhuǎn)錄酶。-RT曲線(xiàn)證明了利用RNeasy FFPE Kit純化的RNA幾乎不含基因組DNA。
圖12. 從FFPE組織中純化miRNA。大鼠肝臟組織用福爾馬林固定24小時(shí)或60小時(shí)，接著用miRNeasy FFPE Kit純化包括miRNA在內(nèi)的總RNA。純化所得的RNA作為模板，并利用miScript PCR System開(kāi)展實(shí)時(shí)定量RT-PCR，以檢測(cè)miR-16和miR-29a以及較大的PGK1基因mRNA。結(jié)果表明了同一洗脫液中miRNA以及mRNA的成功檢測(cè)。
6 蛋白的純化
與核酸不同，F(xiàn)FPE樣品中的蛋白不會(huì)遇到片段化的問(wèn)題。因此，全長(zhǎng)蛋白的分離是可以實(shí)現(xiàn)的。然而，從FFPE樣品中抽提蛋白時(shí)，也會(huì)面臨一些重要的問(wèn)題。首先，如果下游應(yīng)用需要樣品裂解液，而不是高度純化的蛋白，則石蠟的*去除是必需的。其次，蛋白酶K和高度變性劑不能用來(lái)斷開(kāi)福爾馬林交聯(lián)，因?yàn)樗鼈儠?huì)導(dǎo)致蛋白降解。
蛋白純化的效率受到切片厚度的影響。我們建議樣品厚度在10-15 μm。產(chǎn)量取決于切片中組織的量和組織的性質(zhì)。肝臟組織的3塊10 μm切片的一般產(chǎn)量為1.5 μg/μl，而大腦組織為1.6 μg/μl。
Qproteome FFPE Tissue Kit利用技術(shù)從FFPE樣品中回收全長(zhǎng)蛋白。在二甲苯多次處理去除石蠟后，組織切片在優(yōu)化的提取緩沖液中孵育2次。*次是100°C、20分鐘，以逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)。第二次是80°C、2小時(shí)，以確保蛋白溶解度zui高。zui終獲得了100 μl包含蛋白的裂解液，適用于質(zhì)譜和western blot分析等應(yīng)用（圖13）。
圖13. 乳腺癌活檢中HER2的檢測(cè)。利用Qproteome FFPE Tissue Kit處理8個(gè)FFPE乳腺組織，并通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白。在western blotting之后，與HER2（上圖）或β-actin（下圖，對(duì)照）抗體雜交。在從FFPE組織提取的蛋白樣品中，可檢測(cè)到HER的p185和p95形式。（數(shù)據(jù)由德國(guó)慕尼黑理工大學(xué)的Karl-Friedrich Becker和Christina Schott友情提供。）
Qproteome FFPE Tissue 2D-PAGE Kit提取的蛋白適用于2D-PAGE。在為2D-PAGE樣品專(zhuān)門(mén)開(kāi)發(fā)的脫蠟步驟后，使用與Qproteome FFPE Tissue Kit相同的提取緩沖液逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)?；厥蘸蟮牡鞍卓擅擕}，以去除可能影響下游2D-PAGE分析的鹽。純化的蛋白同樣適用于質(zhì)譜分析（圖14）。
圖14. 來(lái)自FFPE和新鮮冰凍樣品的蛋白的質(zhì)譜分析。利用Qproteome FFPE Tissue 2D-PAGE Kit從FFPE和新鮮冰凍的大鼠肝臟中純化蛋白。3塊150 mm2 FFPE組織切片的蛋白產(chǎn)量是80 μg。圖中顯示了A 水解FFPE和B 新鮮肝臟組織的LC耦合串聯(lián)質(zhì)譜分析的總離子流圖。160分鐘內(nèi)上樣的LC梯度是5%-40%溶劑B。分析是在Orbitrap™ XL質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技）上開(kāi)展的，將5 μg*水解肽段混合物上樣到與質(zhì)譜儀耦合的HPLC柱中，這些肽段來(lái)自從A FFPE或B 新鮮冰凍組織中提取的蛋白水解產(chǎn)物。在分析相同量的起始材料時(shí)，新鮮冰凍和FFPE組織都鑒定出大約86.7%的總蛋白。（數(shù)據(jù)引用自Geoui, T. et al. [2010] Extraction of Proteins from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Using the Qproteome Extraction Technique and Preparation of Tryptic Peptides for Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. 90, 10.27.1）
7 多個(gè)分析物的同時(shí)純化
如果能夠同一個(gè)FFPE樣品中純化得到DNA和RNA，那么可以實(shí)現(xiàn)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠比較。在研究健康和惡性細(xì)胞呈異質(zhì)性分布的腫瘤組織時(shí)，這尤為重要：它意味著同一個(gè)樣品的不同切片可能在細(xì)胞組成上存在不同。將樣品分成兩半，進(jìn)行不同的DNA和RNA純化操作，會(huì)導(dǎo)致不同細(xì)胞群體的DNA和RNA的純化，而它們的性質(zhì)可能不同。從同一個(gè)樣品中純化DNA和RNA可避免浪費(fèi)，因?yàn)镕FPE樣品很珍貴，往往難以提取，且數(shù)量有限。
然而，從同一個(gè)樣品中分離DNA和RNA存在一個(gè)主要障礙：片段化的DNA很短，且部分是單鏈的，因此與RNA更為相似。片段化DNA的這種性質(zhì)造成DNA和RNA的物理分離十分困難。AllPrep® DNA/RNA FFPE Kit利用一種申請(qǐng)中的溶解方法來(lái)分別釋放單個(gè)FFPE樣品中的DNA和RNA。通過(guò)這種方法，F(xiàn)FPE樣品在一種經(jīng)過(guò)優(yōu)化的裂解液中孵育，導(dǎo)致RNA的釋放和DNA的沉淀。離心之后，包含RNA的上清和包含DNA的沉淀可分別處理，以純化RNA和DNA。進(jìn)一步孵育部分逆轉(zhuǎn)了交聯(lián)，之后利用RNeasy MinElute離心柱或QIAamp MinElute離心柱純化RNA或DNA。對(duì)于純化后的RNA，柱上DNase處理可去除任何污染的DNA（圖16C）。
取決于RNA結(jié)合條件，小的RNA如miRNA可能存在于純化后的RNA中，也可能不存在。對(duì)于純化后的DNA，可選擇柱上RNase處理，因?yàn)殡x心柱處理之前的DNA和RNA分離，RNA污染很少。
利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit純化得到的DNA和RNA與分別利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit和RNeasy FFPE Kit/miRNeasy FFPE Kit純化得到的DNA和RNA質(zhì)量相當(dāng)（圖15）。因此，純化得到的核酸適合實(shí)時(shí)定量PCR和RT-PCR（圖16）或焦磷酸測(cè)序等下游應(yīng)用。
圖15. FFPE樣品中DNA和RNA的純化。A 從各種大鼠FFPE組織中純化的基因組DNA在室溫下保存時(shí)間。純化是利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（作為對(duì)照，一個(gè)專(zhuān)門(mén)從FFPE樣品中純化DNA的試劑盒）開(kāi)展的，兩者都包含了RNase消化。通過(guò)測(cè)量吸光度來(lái)確定每個(gè)20 μm 切片樣品的DNA產(chǎn)量。B 從各種大鼠FFPE組織中純化的RNA在室溫下保存時(shí)間。純化是利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或RNeasy FFPE Kit（作為對(duì)照，一個(gè)專(zhuān)門(mén)從FFPE樣品中純化RNA的試劑盒）開(kāi)展的。通過(guò)測(cè)量吸光度來(lái)確定每個(gè)10 μm 切片樣品的RNA產(chǎn)量。在回收FFPE樣品中的DNA/RNA時(shí)，AllPrep試劑盒的表現(xiàn)與專(zhuān)門(mén)的DNA/RNA純化試劑盒一樣好。
圖16. FFPE樣品中DNA和RNA的可靠擴(kuò)增。利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或作為對(duì)照的專(zhuān)門(mén)從FFPE樣品中純化DNA或RNA的試劑盒（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或RNeasy FFPE Kit）從各種大鼠FFPE組織中純化A DNA和B, C RNA。在ABI PRISM® 7900HT 序列檢測(cè)系統(tǒng)上開(kāi)展實(shí)時(shí)定量PCR或RT-PCR，A 利用QuantiTect SYBR Green PCR Kit來(lái)分析Prnp基因的78 bp擴(kuò)增子，或B, C 利用QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit來(lái)分析Jun癌基因表達(dá)。AllPrep試劑盒和專(zhuān)門(mén)的試劑盒產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)腃T值，說(shuō)明所有試劑盒在回收可用的DNA或RNA上效率相似。C 此外，Jun表達(dá)的分析在無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶（-RT）下開(kāi)展。脾臟樣品（富含DNA的組織）的擴(kuò)增曲線(xiàn)表明幾乎沒(méi)有基因組DNA污染。
8 提取和純化的自動(dòng)化
FFPE分析物純化的自動(dòng)化具有一些優(yōu)勢(shì)，包括純化過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化的提高和勞動(dòng)力的降低。它還有利于多個(gè)樣品的處理。QIAcube讓QIAGEN離心柱試劑盒自動(dòng)化，包括QIAamp DNA FFPE Tissue Kit、RNeasy FFPE Kit和miRNeasy FFPE Kit，讓您快速啟動(dòng)低通量的自動(dòng)化純化（每次zui多運(yùn)行12個(gè)樣品）。對(duì)于低-中等通量的FFPE樣品的DNA純化，EZ1® Advanced儀器每次運(yùn)行可純化1-6或1-14個(gè)FFPE樣品，它使用EZ1 DNA Paraffin Section Card和EZ1 DNA Tissue Kit。EZ1 Advanced儀器帶來(lái)了高的操作安全性，無(wú)憂(yōu)的數(shù)據(jù)管理和快速運(yùn)行時(shí)間。
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