*福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片的存檔代表了珍貴且來源廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究材料。隨著越來越多的研究人員轉(zhuǎn)向FFPE樣品的分子分析，開發(fā)特定的操作步驟，考慮這些樣品的*性質(zhì)就變得越來越重要。本文為完整的FFPE流程提出了建議。其中介紹了制備和保存FFPE樣品的方法，其目的在于盡量減少因固定和包埋過程而引起的DNA、RNA和蛋白質(zhì)量下降。接下來介紹了流程中的提取和分析步驟，并詳細介紹了如何地從FFPE樣品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便開展逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR等下游應(yīng)用。
一、制備和存檔FFPE樣品時的重要考慮因素
從FFPE樣品中提取出的核酸和蛋白的質(zhì)量取決于固定和包埋之前、期間和之后如何處理樣品。在這一部分，我們確定了影響生物分子質(zhì)量的主要因素，并建議采取哪些措施，以盡量減少這些因素的影響。
1 樣品類型
每種組織都有其特定的生理功能，并就其結(jié)構(gòu)和組成細胞而言是*的。取決于組織類型，收獲后生物分子降解、誘導(dǎo)或修飾的速度可能各異。因此，組織切除和固定的操作應(yīng)盡快開展（詳見2 樣品處理）。從富含纖維或脂肪的FFPE組織中純化分析物時，不需要特殊的裂解條件：相反，福爾馬林交聯(lián)和石蠟的存在決定了分析物提取的要求。
在處理腫瘤組織時，應(yīng)當(dāng)注意健康和惡性細胞并不是均勻分布的。因此，同一個組織樣品中一塊切片的分析結(jié)果可能與另一塊切片不同。
2 樣品處理
從病人身上獲得組織標(biāo)本的手術(shù)涉及麻醉、血管結(jié)扎、組織的切除以及固定。從病人麻醉到組織固定這段時間內(nèi)，組織中的基因表達可能發(fā)生變化，且可能發(fā)生組織自溶。因此，組織固定前的操作時間應(yīng)當(dāng)越短越好，以避免RNA轉(zhuǎn)錄本和蛋白表達譜發(fā)生明顯改變。操作中每一步的時間應(yīng)記錄在案，這是zui低要求。
3 福爾馬林固定
組織的固定是將標(biāo)本放在福爾馬林溶液中，此溶液的組分可能有所差異（典型的10%福爾馬林溶液可能含有3.7% 甲醛以及1-1.5% 甲醇）。產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致生物分子之間的交聯(lián)，包括核酸之間、蛋白之間，以及核酸和蛋白之間的交聯(lián)。為了獲得*的結(jié)果，應(yīng)當(dāng)使用中性的福爾馬林緩沖溶液，以取代無緩沖或酸性的溶液。中性緩沖液減緩福爾馬林的降解，而通常認為其降解產(chǎn)物會損害核酸的質(zhì)量。
而另外3個影響組織固定程度的因素也很重要：組織標(biāo)本的厚度、福爾馬林溶液的體積和固定過程的持續(xù)時間。固定不足（underfixation）可導(dǎo)致組織標(biāo)本中福爾馬林未滲入的較深區(qū)域的核酸和蛋白降解，或基因表達發(fā)生改變。過度固定（overfixation）則導(dǎo)致更密集的交聯(lián)，讓有用核酸和蛋白的提取變得更加困難。
福爾馬林大約以1 mm/小時的速率滲透組織。此外，福爾馬林的滲透速率隨組織厚度的增加而降低。因此，在固定一個組織標(biāo)本時，它應(yīng)當(dāng)足夠薄，以避免周邊的過度固定和中間的固定不足。在一個比較不同大小樣品固定過程的實驗中，QIAGEN的研究人員發(fā)現(xiàn)，在固定整個組織（厚度大約1 cm），而不是組織切片（厚度約4 mm或以下）時，RNA顯著降解（圖1）。為了獲得*的結(jié)果，通常建議固定zui多5 mm厚的組織標(biāo)本。
福爾馬林與組織的比例至少應(yīng)為10:1，以確保*的固定。在處理小的組織標(biāo)本，如穿刺活檢時，這很容易實現(xiàn)。然而，在處理大的組織樣品時，固定所用的福爾馬林可能不足。在這種情況下，組織切片應(yīng)當(dāng)切割后再進行福爾馬林固定。
組織的固定不應(yīng)超過24小時，以避免過度固定。在一個比較過夜固定和72小時固定的實驗中，QIAGEN的科學(xué)家觀察到，固定時間對RNA完整性幾乎無影響（圖2）。然而，他們也發(fā)現(xiàn)，72小時固定對純化后RNA在一步法RT-PCR中的表現(xiàn)有不利影響：較大的擴增子無法成功擴增，這極有可能是因為RNA分子的過度交聯(lián)和較高比例的不可逆交聯(lián)（圖1）。另一個實驗表明，72小時的固定降低了FFPE樣品中蛋白的回收率（圖3）。這種不利影響同樣是由于交聯(lián)增加。
圖1. 樣品厚度對RNA完整性的影響。大鼠組織以整個器官或≤4 mm的切片進行福爾馬林固定和石蠟包埋。A 包埋后3天利用RNeasy® FFPE Kit 純化RNA，并利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。在整個大腦的電泳峰圖中，雙箭頭指出了18S rRNA和28S rRNA的峰減少，表明RNA片段化的增加。B 純化的RNA被用于一步法RT-PCR中，利用大鼠Rpl4基因特異的不同引物對和QIAGEN OneStep RT-PCR Kit。從左到右，擴增子大小分別為96、206、400、613和785個核苷酸。整個器官的分析中較大擴增子的缺失表明較大的RNA存在降解。（數(shù)據(jù)引用自von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）
圖2. 固定時間對RNA完整性和一步法RT-PCR的影響。各種大鼠組織經(jīng)過福爾馬林固定（過夜或3天）和石蠟包埋。為了比較，大鼠組織以RNAlater® RNA Stabilization Reagent穩(wěn)定。包埋后3天利用RNeasy® FFPE Kit純化RNA，并利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。此外，利用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit和大鼠Rpl4基因特異的引物對開展一步法RT-PCR。擴增子大小如圖所示，RT-PCR的結(jié)果以顏色顯示：紅色表示無擴增；黃色表示弱的擴增；綠色表示成功的擴增。盡管較長時間的固定對RNA片段化和核糖體條帶影響甚微，但較長擴增子的擴增效率差。（數(shù)據(jù)引用自von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）
圖3. 固定時間對蛋白提取的影響。利用10%中性的福爾馬林緩沖溶液按照圖中所示的時間固定大鼠組織，然后用石蠟包埋。利用Qproteome® FFPE Tissue Kit提取總蛋白。開展A SDS-PAGE分析和B Western blot分析（利用β-actin的抗體）。兩種分析表明，固定時間長于24小時會降低所提取蛋白的量。4 石蠟包埋
在福爾馬林固定之后，組織標(biāo)本包埋在石蠟中，此過程包含幾步。*步是脫水，其中水被替換成醇類，通常為乙醇。接著是透明，其中醇類被替換成二甲苯或二甲苯替代物，之后是浸蠟，其中二甲苯被置換成石蠟。zui后一步是包埋，整個標(biāo)本被石蠟包圍。在浸蠟之前，組織標(biāo)本必須*脫水，因為殘留的水分可能導(dǎo)致樣品降解。石蠟包埋是維持蛋白完整性的關(guān)鍵一步，因為殘留的水分可能導(dǎo)致蛋白水解。因此，應(yīng)當(dāng)使用未經(jīng)水稀釋的高質(zhì)量試劑，且整個包埋過程的持續(xù)時間和溫度應(yīng)當(dāng)優(yōu)化，以實現(xiàn)*的脫水。我們建議使用新鮮的醇類和二甲苯，以避免過去使用時水分殘留的可能。
浸蠟和包埋福爾馬林固定組織中使用的石蠟的熔解溫度和組分可能各異。在使用熔解溫度高的石蠟時，包埋過程需要較高的溫度，這可能導(dǎo)致樣品降解增加。為了確保從FFPE樣品中可用核酸和蛋白的理想回收，應(yīng)當(dāng)使用熔解溫度低的石蠟。此外，應(yīng)當(dāng)避免包含添加劑如蜂蠟的石蠟，因為它們可能干擾生物分子的回收。
5 染色
為了避免FFPE樣品分子分析的問題，樣品染色應(yīng)盡可能避免。某些染料和試劑可能對核酸造成不利影響，特別是那些用于免疫組化染色的試劑。涉及高pH和重金屬離子的染色步驟應(yīng)當(dāng)避免。如果樣品染色是必需的，則甲酚紫（cresyl violet），因為它與核酸分析兼容。
從那些利用組織學(xué)染料（如蘇木精或固紅）進行染色的切片中純化蛋白，可能導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量的顯著下降。然而，純化后的蛋白可用于western blotting或反相蛋白芯片分析等下游應(yīng)用。
6 樣品保存
在固定和包埋之后，F(xiàn)FPE樣品應(yīng)在*溫度下保存，這樣可減緩核酸和蛋白的降解。在一個比較不同保存溫度的實驗中，QIAGEN的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，如果FFPE樣品保存在4°C，而不是室溫或更高，則RNA在1年后仍基本完整（圖4）。
由于FFPE樣品中的RNA常常嚴(yán)重片段化，所以對小分子RNA如microRNA（miRNA）而言，回收基本完整RNA的機會高于較長的RNA如mRNA。這意味著檢測短擴增片段的分析（如特定miRNA的分析）受福爾馬林固定的影響比檢測長擴增子的分析（如特定mRNA轉(zhuǎn)錄本的分析）要?。▓D5）。
圖4. 保存溫度對RNA完整性的影響。各種大鼠組織經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋。在包埋后3天（T0）或在4°C、20-25°C或37°C保存一年后利用RNeasy FFPE Kit純化RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer上分析RNA完整性。對于保存在4°C的樣品，18S rRNA和28S rRNA對應(yīng)的峰清晰可見，表明存在完整RNA，而保存在較高溫度下的樣品卻并非如此。（數(shù)據(jù)引用自von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）
圖5. 保存條件對實時定量RT-PCR表現(xiàn)的影響取決于RNA大小。各種大鼠組織經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋。利用miRNeasy FFPE Kit純化得到包含小分子和大分子RNA的總RNA。在包埋后3天（T=0）、室溫下保存6個月和37°C保存6個月的RNA樣品作為模板，利用miScript PCR System開展實時定量RT-PCR。在ABI 7900循環(huán)儀上開展反應(yīng)。A microRNA miR-29（模板長度：22 nt）和B Hprt1轉(zhuǎn)錄本（擴增子長度：94 bp）被檢測到。6個月的保存對mRNA分析表現(xiàn)的影響大于對miRNA分析的影響，表明RNA片段化對較長模板檢測的影響比極短模板檢測要大。
