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免疫組化全攻略1:新手必讀

閱讀:430發(fā)布時間:2013-3-8

在上世紀30年代,免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,簡稱IHC)的原理就已經(jīng)為人所知,但直到1942年,*個IHC研究成果才正式發(fā)表。這也被譽為免疫熒光技術(shù)的里程碑。哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Albert Coons在《免疫學(xué)雜志》上發(fā)表文章,利用FITC標記的抗體來鑒定感染組織中的肺炎球菌抗原。1自那以后,組織固定方法、檢測標記和顯微鏡都在不斷改進,讓免疫組化成為診斷和研究中的一個*工具。
在病理科,利用特異的腫瘤標志物,醫(yī)生通過IHC診斷腫瘤是良性還是惡性,確定腫瘤的分期和分級,并確定細胞類型和轉(zhuǎn)移的來源,以便找到原發(fā)腫瘤的位置。同樣,IHC也能用于藥物開發(fā),通過檢測疾病靶點的上調(diào)或下調(diào)來判斷藥物療效。
免疫組化指的是根據(jù)抗體與抗原特異結(jié)合的原理來檢測組織切片中的抗原(如蛋白)。immuno的詞根來自操作中所使用的抗體,而histo意味著組織。另一種類似的技術(shù)是免疫細胞化學(xué)(Immunocytochemistry,簡稱ICC)。這兩個詞大家經(jīng)?;熘茫粗孟癫畈欢?,但實際上還是有點區(qū)別。這里順便說說。
IHC vs. ICC
對于IHC,組織是來自患者或動物,經(jīng)過冷凍或石蠟包埋。將這些組織制成約4μm厚的切片,封片后再處理。通過這種方法,研究人員可觀察細胞組分的定位,同時維持周圍組織的原先結(jié)構(gòu)。
對于ICC,大部分細胞外基質(zhì)及其他基質(zhì)組分被去除,只剩下整個細胞來染色。ICC的來源可以是細胞懸液,來自患者或動物(如血涂片、拭子等),或在實驗室中進行的組織培養(yǎng)細胞系。
除了生物學(xué)來源,IHC和ICC在樣品處理的程度上也有所不同。ICC需要透化,要么通過固定過程,要么是單獨的透化步驟,這樣抗體才能與細胞內(nèi)的靶點相結(jié)合。而IHC可能不要單獨的透化步驟,這取決于切片的厚度和固定方法。包埋在石蠟中的IHC切片必須進一步處理,才能進行抗體染色。一旦處理好樣品,IHC和ICC的染色操作就幾乎沒什么差異了。當然,就染色而言,根據(jù)所使用的抗體來優(yōu)化還是少不了的。
設(shè)計一個成功的IHC/ICC實驗
從技術(shù)上講,IHC的原理很簡單。首先固定樣品,以保留細胞完整性,之后與封閉液共同孵育,避免抗體的非特異結(jié)合。隨后將樣品先后與一抗和二抗孵育,并通過顯微鏡分析觀察信號。
然而,這并不意味著實驗很好做。zui大的挑戰(zhàn)在于如何確定*的實驗條件,讓每個抗原都產(chǎn)生強烈而特異的信號。如果是個高豐度蛋白,那么挺好辦,需要的固定時間短,封閉時間短,可以用熒光標記一抗直接檢測。但如果要檢測冰凍切片中的磷酸化蛋白呢?那可能需要抗原修復(fù),外加放大檢測。
R&D Systems的列出了IHC/ICC實驗設(shè)計和優(yōu)化的變量,如下表。

看完這些,是不是覺得有些頭暈?zāi)兀@么多地方需要優(yōu)化。其實也沒那么恐怖,生物通接下來會發(fā)布一些優(yōu)化指南,包括如何制備樣品,如何選擇固定劑,如何優(yōu)化抗體檢測等,千萬別錯過。此外,R&D Systems等也公布了免疫組化的基本操作,以及檢測特定抗原的具體條件,可供您參考。


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