說(shuō)到甲基化分析，在我的印象中，QIAGEN是比較早推出相關(guān)產(chǎn)品的。它的EpiTect Bisulfite Kit可在6小時(shí)將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶*轉(zhuǎn)化成*，且手工操作極少。與傳統(tǒng)方法相比，算是一大進(jìn)步。后來(lái)，其他廠家也陸陸續(xù)續(xù)推出了類似產(chǎn)品，速度越來(lái)越快。當(dāng)然，QIAGEN也不甘落后，推出了新一代的產(chǎn)品。
EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit能夠在30分鐘內(nèi)非常地將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成*，且轉(zhuǎn)化率超過(guò)99%。而創(chuàng)新的DNA保護(hù)技術(shù)能確保的DNA變性，但不會(huì)降解，獲得高的DNA產(chǎn)量和重復(fù)的結(jié)果。此外，轉(zhuǎn)化后的DNA可在低至10 µl洗脫液中洗脫，產(chǎn)生高濃度的DNA。轉(zhuǎn)化后的DNA適合各種甲基化分析技術(shù)，包括各種PCR、亞硫酸氫鹽測(cè)序、COBRA和焦磷酸測(cè)序等。
快速的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化
試劑盒中的秘密就在于一種高濃度的亞硫酸氫鹽溶液，它能夠?qū)⑥D(zhuǎn)化的時(shí)間從幾小時(shí)縮短至30分鐘。此外，亞硫酸氫鹽熱循環(huán)程序帶來(lái)了一系列經(jīng)過(guò)優(yōu)化的孵育步驟，以便開展DNA變性、磺化和胞嘧啶脫氨基，實(shí)現(xiàn)了超過(guò)99%的胞嘧啶轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過(guò)程的zui后一步，脫磺酸基，是在柱上輕松完成的。
DNA保護(hù)
在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，我們通常還要面臨一個(gè)問(wèn)題，那就是DNA的降解。因?yàn)閬喠蛩釟潲}處理的劇烈條件，DNA會(huì)片段化，從而降低了PCR及后續(xù)分析技術(shù)的靈敏度。通常，亞硫酸氫鹽處理需要大量的起始DNA，以補(bǔ)償轉(zhuǎn)化過(guò)程中的DNA降解和純化過(guò)程中的DNA損失。而對(duì)于EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit，其*配方的DNA Protect Buffer可避免這種DNA段化。同時(shí)，它也實(shí)現(xiàn)了有效的DNA變性，產(chǎn)生了足夠的單鏈DNA。DNA Protect Buffer還包含了一種方便的pH指示劑染料，從而保證胞嘧啶轉(zhuǎn)化時(shí)正確的pH條件。
針對(duì)不同的起始樣品，這一產(chǎn)品線又具體分為三個(gè)產(chǎn)品：適用于基因組DNA的EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit、適用于FFPE樣品的EpiTect Fast FFPE Bisulfite Kit以及適用于全血、細(xì)胞或組織的EpiTect Fast LyseAll Bisulfite Kit。它們的樣品制備有所不同，但之后所有樣品類型的DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化都是相同的。大致有以下幾步：亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的未甲基化胞嘧啶的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后單鏈DNA與膜結(jié)合，洗滌，膜結(jié)合DNA的脫磺酸基，洗滌，轉(zhuǎn)化后DNA的洗脫。
EpiTect Fast FFPE Bisulfite Kit還包含了將FFPE組織脫蠟和裂解所需的特殊緩沖液。從FFPE組織提取DNA時(shí)，不可避免地會(huì)發(fā)生DNA片段化，而亞硫酸氫鹽處理的劇烈條件通常會(huì)使情況更糟。而QIAGEN的DNA保護(hù)技術(shù)盡量減少這一過(guò)程中的片段化，讓DNA產(chǎn)量更佳。EpiTect Fast LyseAll Bisulfite Kit則通過(guò)一種創(chuàng)新的裂解緩沖液來(lái)處理全血、細(xì)胞或組織樣品。它可處理0.5-20 µl全血或10-105個(gè)細(xì)胞（低至60 pg DNA）。
此外，QIAGEN還推出了96孔板形式的快速轉(zhuǎn)化試劑盒——EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kit，實(shí)現(xiàn)了高通量的DNA轉(zhuǎn)化和純化。試劑盒也分為三種形式：普通、FFPE和LyseAll。
會(huì)員1.png)