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技術(shù)文章

顯著降低蛋白質(zhì)樣品的復(fù)雜度

閱讀:324發(fā)布時(shí)間:2013-3-5

蛋白質(zhì)組的研究不僅能為生命活動(dòng)規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ),也能為眾多種疾病機(jī)理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。由于基因表達(dá)往往是通過(guò)基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)蛋白質(zhì)前體,在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行加工、修飾,才成為一個(gè)具有生物活性的蛋白質(zhì),所以同樣的一個(gè)基因在不同條件、不同時(shí)間和空間可能不只有一種相應(yīng)的蛋白質(zhì),可能會(huì)有幾種,甚至幾十種對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)存在。正是蛋白質(zhì)樣品的這種高復(fù)雜度和不同蛋白濃度的高差異性,使蛋白質(zhì)組學(xué)研究面臨著挑戰(zhàn)。 
所以,如果能有一種技術(shù),顯著降低蛋白質(zhì)樣品的復(fù)雜程度,將大大提高蛋白質(zhì)組學(xué)研究的效率。而Agilent 3100 OFFGEL等電聚焦分離儀正是這樣一款儀器,它能顯著降低蛋白質(zhì)樣品復(fù)雜度,提高后續(xù)分析的靈敏度及分辨率。
3100 OFFGEL的技術(shù)原理
基于等電點(diǎn)在液相環(huán)境下分級(jí)分離蛋白質(zhì)或多肽,即蛋白或多肽樣品置于IPG(固化PH梯度)膠條上方間隔中(內(nèi)含緩沖液),在電場(chǎng)作用下,樣品在IPG膠條中遷移,逐步等電分離,zui終樣品保留在上層緩沖液中,可方便的取樣進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)之前,蛋白或多肽樣品直接加到緩沖液中,免去了樣品溶入IPG膠條的步驟;
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,樣品保留在溶液中,避免了割膠回收的步驟。
Agilent 3100 OFFGEL的主要作用在蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中,Agilent 3100 OFFGEL主要用于對(duì)蛋白樣品進(jìn)行基于等電點(diǎn)的預(yù)分離,顯著降低蛋白樣品的復(fù)雜度,提高下游檢測(cè)的靈敏度。蛋白組學(xué)研究的三大支撐技術(shù):雙向電泳、質(zhì)譜和計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù),后兩種技術(shù)都可以和Agilent 3100 OFFGEL配合使用,對(duì)樣品實(shí)現(xiàn)預(yù)分離。根據(jù)所用試劑盒可達(dá)到pH 0.1–0.6的分辨率,而且溶液中的分離成分回收,方便了LC/MS分析。
3100 OFFGEL如何配合LC-MS/MS使用?一般的LC/MS工作流程是:生物樣品(細(xì)胞、血漿、血清、體液等)裂解——蛋白提取——*消化成肽段(根據(jù)需要進(jìn)行凍干、用甲酸重溶解、純化等步驟)——3100 OFFGEL(約20h)——液相回收多肽——脫鹽——凍干——用甲酸重溶解——上LC-MS——獲得的肽段與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比,鑒定肽段(注:1. 蛋白提取后,可以不用*消化,直接上樣,相對(duì)肽段樣品來(lái)說(shuō)回收率低,靈敏度也低;2. 在凍干前是否需要脫鹽取決于LC-MS是否有在線脫鹽功能)。
3100 OFFGEL的優(yōu)勢(shì)有哪些?
1、3100 OFFGEL 可以顯著提高M(jìn)S分析的蛋白檢出率使用OFFGEL分離后,質(zhì)譜檢測(cè)出蛋白數(shù)是先前的4倍
2、3100 OFFGEL 的蛋白或多肽分離結(jié)果具有*的重復(fù)性同一樣品用OFFGEL進(jìn)行3次分離,跑SDS-Page驗(yàn)證OFFGEL分離的重現(xiàn)性 
3、3100 OFFGEL的分離結(jié)果具有*的分辨率3100 OFFGEL的技術(shù)特點(diǎn)
• 基于PI的游離膠 預(yù)分餾,根據(jù)所用試劑盒可達(dá)到pH 0.1–0.6的分辨率
• 溶液中的分離成分回收,方便了LC/MS分析
• 兩個(gè)電源設(shè)置允許同時(shí)分離兩組濃度相差很大的樣品
• 一次可同時(shí)分餾多達(dá)16個(gè)樣品
• OFFGEL(游離膠)或INGEL(傳統(tǒng)IEF)兩種模式可選
• 寬范圍上樣量:50 μg ~ 5 mg 
• 高回收率:蛋白>70%,多肽>80%
• 開(kāi)放耗材:多種 IPG-strips可供選擇
• 可進(jìn)行實(shí)時(shí)“診斷”:通過(guò)觀察電流變化判斷樣本的分離情況
• 簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、容易使用 
• 整合性:可以兼容多個(gè)系統(tǒng)完成一系列工作,例如整合MARS, LC/MS, mRP以及生物分析儀等


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