潔凈車間用食品廠臭氧機滅菌后沉降菌檢測方法

      潔凈車間滅菌方法有多種：紫外線滅菌、化學熏蒸、臭氧滅菌等；這里簡單介紹臭氧滅菌后對潔凈車間沉降菌的檢測":

A:操作方法：對潔凈車間用食品廠臭氧機{車間臭氧機}滅菌1小時后進行沉降菌檢測

 B:名稱：潔凈區(qū)微生物檢測操作規(guī)程

C:關(guān)鍵詞：潔凈區(qū)、食品廠臭氧機、車間臭氧機、微生物檢測

D:目的：尋得優(yōu)質(zhì)食品廠臭氧機、車間臭氧機廠家并規(guī)范潔凈區(qū)微生物檢測

E:原理：臭氧滅菌技術(shù)

F:適用范圍：100級、1萬、10萬、30萬級潔凈區(qū)環(huán)境。

1.        沉降菌檢測

1）       在萬級潔凈區(qū)內(nèi)的關(guān)鍵操作點和潔凈室內(nèi)每周檢測一次沉降菌和浮游菌；在10萬級潔凈區(qū)內(nèi)其檢測頻次為每月檢測一次。30萬級每季度檢測一次沉降菌。

2）       由微生物檢測員按《養(yǎng)基的配制操作規(guī)程的要求配制肉湯瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿使用Φ90mm×15mm，于121℃濕熱滅菌20分鐘，取出備用。

3）       做好潔凈區(qū)消毒工作，開啟潔凈區(qū)凈化空調(diào)系統(tǒng)，正常運行不少于30分鐘；對單向流如100級的凈化工作臺和層流罩要在凈化系統(tǒng)運行10min后開始。

4）       靜態(tài)測試在除測試人員外，室內(nèi)無生產(chǎn)人員的情況下進行，動態(tài)測試在已處于正常生產(chǎn)狀態(tài)下進行。

5）       采樣點布置選用對角線法，要求布置地面四個方向，工作線上左右，關(guān)鍵設備頂上放置一個。

6）       萬級、10萬級、30萬級的zui少采樣點數(shù)可按下表確定。

在滿足zui少測點數(shù)的同時，還宜滿足zui少培養(yǎng)皿數(shù)，見下表

7）       百級區(qū)只有凈化工作臺下的局部范圍，其面積小于10m2，因此百級區(qū)取樣點至少為3個。

8）       測試人員按潔凈室級別規(guī)定的程序更換潔凈服進入潔凈區(qū)；靜態(tài)測試時，室內(nèi)人員不得多于2人。

9）       將制備好的肉湯瓊脂培養(yǎng)基按采樣點布點位置離地0.8～1.5m處放置，打開培養(yǎng)皿蓋，暴露30分鐘，檢測人員及時填寫記錄，記錄房間溫濕度，壓差及測試狀態(tài)。

10）    蓋好皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在30～35℃中培養(yǎng)48小時，并用3只培養(yǎng)皿作對照。

11）    用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細觀察平皿上所有菌落數(shù)，要注意菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，然后用5～10倍放大鏡檢查有否遺漏。

12）    計算平均菌落數(shù)=（M1＋M2……＋Mn）／n，式中M1：1號培養(yǎng)皿菌落數(shù)，M2：2號培養(yǎng)皿菌落數(shù)，n：培養(yǎng)皿數(shù)。

13）    用平均菌落數(shù)判斷潔凈室空氣中的微生物，潔凈區(qū)的平均菌落數(shù)（靜態(tài)測試）：100級≤1個/皿，萬級≤3個／皿，10萬級≤10個／皿，30萬級≤15個／皿。

14）    如超過標準，則必須對此區(qū)域重新消毒，重新采樣兩次，測試結(jié)果均須合格；否則要向質(zhì)量管理部通報，并采取相應的措施。

15）    檢測人員必須向QA部門發(fā)“潔凈級別檢測記錄”，取樣和微生物培養(yǎng)及檢測人員均要在記錄上簽名，QA部門主管審核，記錄由質(zhì)量管理部保存三年。

2.        浮游菌檢測

1）       對萬級和10萬級潔凈區(qū)要進行浮游菌的檢測，在萬級區(qū)內(nèi)的關(guān)鍵操作點和潔凈室內(nèi)每周檢測一次，10萬級潔凈區(qū)內(nèi)其檢測頻次為每月檢測一次。

2）       浮游菌取樣使用浮游菌采樣器，采樣器必須要有流量計和定時量，并按儀器的檢定周期，定期對儀器作檢定，以保證測試數(shù)據(jù)的可靠性。

3）       采樣器進入被測房間前要先用消毒劑滅菌，用于100級潔凈室的采樣器是一直放在房間內(nèi)；采樣時使用規(guī)定為Φ150mm×15mm培養(yǎng)皿。

4）       由微生物檢測人員按《培養(yǎng)基的配制操作規(guī)程》的要求配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于121℃濕熱滅菌20分鐘，取出備用。

5）       浮游菌取樣與沉降菌一樣可分為靜態(tài)測試和動態(tài)測試兩種狀態(tài)；各種潔凈度的采樣點數(shù)目和zui小采樣量如下表所示。

浮游菌取樣點數(shù)目及zui小采樣量

滅菌原理

臭氧是一種強氧化劑，滅菌過程屬生物化學氧化反應。臭氧滅菌有以下3種形式：

1.臭氧能氧化分解細菌內(nèi)部葡萄糖所需的酶，使細菌滅活死亡。

2.直接與細菌、病毒作用，破壞它們的細胞器和DNA、RNA，使細菌的新陳代謝受到破壞，導致細菌死亡。

3.透過細胞膜組織，侵入細胞內(nèi)，作用于外膜的脂蛋白和內(nèi)部的脂多糖，使細菌發(fā)生通透性畸變而溶解死亡。

臭氧殺菌

滅活機理

臭氧對細菌的滅活反應總是進行的很迅速。與其它殺菌劑不同的是：臭氧能與細菌細胞壁脂類雙鍵反應,穿入菌體內(nèi)部，作用于蛋白和脂多糖，改變細胞的通透性，從而導致細菌死亡。臭氧還作用于細胞內(nèi)的核物質(zhì)，如核酸中的嘌呤和嘧啶破壞DNA。

滅活機理

臭氧對病毒的作用首先是病毒的衣體殼蛋白的四條多肽鏈，并使RNA受到損傷，特別是形成它的蛋白質(zhì)。噬菌體被臭氧氧化后，電鏡觀察可見其表皮被破碎成許多碎片，從中釋放出許多核糖核酸，干擾其吸附到寄存體上。

臭氧殺菌的*性是不容懷疑的。

臭氧殺菌原理

臭氧滅菌或抑菌作用，通常是物理的、化學的及生物學等方面的綜合結(jié)果。其作用機制可歸納為：（1）作用于細胞膜，導致細胞膜的通透性增加，細胞內(nèi)物質(zhì)外流，使細胞失去活動；（2）使細胞活動必需的酶失去活性；（3）破壞細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或使其失去功能。臭氧殺滅病毒是通過直接破壞核糖核酸或脫氧核酸完成的。而殺滅細菌、霉菌類微生物則是臭氧首先作用與細胞膜，使細胞膜的構(gòu)成收到損傷，導致新陳代謝障礙并抑制其生長，臭氧繼續(xù)滲透破壞膜內(nèi)組織，直到死亡。

臭氧滅菌

人類自發(fā)現(xiàn)并使用臭氧以來，一直對臭氧的滅菌性能進行試驗[1]，這方面的試驗報告很多，以下從幾個方面進行綜述。

臭氧－細菌繁殖體

李懷恩等觀察了臭氧氣體對空氣中綠膿桿菌的殺滅作用。在15℃，濕度73%，臭氧濃度0.08-0.6ppm時，30分鐘內(nèi)殺滅率達到99.9%以上；伍學洲等試驗臭氧對大腸桿菌殺滅率為*，對*殺滅率為95.9%，對綠膿桿菌殺滅率為89.8%，顧士圻等試驗，臭氧對大腸桿菌和*殺滅率分別為99.7%、99.9%。居喜娟等試驗用臭氧可殺滅空氣中的白色葡萄球菌99.99%；Burleson等試驗將臭氧氣體通入染有*、大腸桿菌、熒光假單胞菌、鼠傷*、福氏痢疾桿菌、霍亂弧菌的磷酸鹽緩沖液中，作用15秒后，以上細菌全部殺滅；白希堯等發(fā)現(xiàn)臭氧水溶液殺菌作用強大，且速度極快，濃度為0.3mg/L的臭氧水溶液作用1分鐘，大腸桿菌和*的殺滅率均達*。

細菌芽胞

瞿發(fā)林等報告，以5.5mg/m?的臭氧作用下45分鐘，可將100mL塑料瓶內(nèi)滴染的枯草桿菌黑色變種芽胞*殺滅；居喜娟等報道，在1m?試驗柜內(nèi)，開啟500mg/h的臭氧發(fā)生器60分鐘可對空氣中的枯草桿菌黑色變種芽胞殺滅率達99.95%；歐陽川等在動態(tài)試驗條件下，將臭氧氣體通入染菌井水中，臭氧濃度達3.8-4.6mg/L時，作用3-10分鐘，水中枯草桿菌黑色變種芽孢殺滅率達99.999%。

病毒

李紹忱等試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10.3mg/m3濃度臭氧作用30分鐘后，乙型肝炎表面抗原（HbsAg）的滴度從1:256降至1:64。史江等報告，臭氧濃度13.6mg/m3時使用30分鐘，使HbsAg破壞99.99%，使用甲型肝炎病毒抗原（HAAg）破壞*；Wolo等實驗證明0.5ppm的臭氧可滅活空氣中的甲型流感病毒99%；Herbold等報告，在20℃水中，臭氧濃度為0.13mg/L時，可以*的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型（PVI）。臭氧滅活病毒速度極快，當臭氧濃度分別為0.09mg/L-0.8mg/L時，在反應zui初5秒鐘內(nèi)，噬菌體T2即可被滅活5-7個對數(shù)值。Finch發(fā)現(xiàn)水中含臭氧濃度40μg/L時，作用20秒鐘，可使大腸桿菌噬菌體ms2滅活4個對數(shù)值。Vaughn等在4℃條件下，對比了臭氧對猿輪狀病毒SA-H和人輪狀病毒2型的滅活效果,發(fā)現(xiàn)兩種病毒均能被0.25mg/L的臭氧迅速滅活。Crpend等檢測了經(jīng)臭氧處理后的血清中愛滋病毒（HIV）的滅活情況，證明當臭氧濃度為4mg/L時，可將滴度為106CID50/mL HIV全部滅活，病毒滴度下降6個對數(shù)值。

真菌

汪華明等報道,臭氧濃度為9.6mg/L時，作用100分鐘對雜色曲霉與桃色擬毒霉的殺滅率達*，對蠟葉枝孢霉23mg/L30分鐘、青黑霉在12.5mg/L作用35分鐘、桔青霉在15.4mg/L作用30分鐘，尖鐮孢霉在15.5mg/L時作用20分鐘，均可達*滅活率。對于煙曲霉、細交鏈孢霉、爪哇毛霉等，在臭氧濃度為3.85-10.7mg/L時作用10-20分鐘滅活率達96.4%。伍學洲等發(fā)現(xiàn)，臭氧在30分鐘內(nèi)對青霉菌的殺滅率為93.8%，對毛霉菌的殺滅率為*；白希堯等報告，濃度為15mg/L的臭氧水溶液作用1分鐘，可*地殺滅試驗中的黑曲霉和酵母。

原蟲

Finch等比較了22℃時臭氧對蘭氏賈弟鞭毛蟲和鼠型賈弟鞭毛蟲色曩的滅活效果，當Ct值0.86mg•min/L時，可使鼠型賈弟鞭毛蟲減少4個對數(shù)值，Ct值為2.5mg•min/L時，使蘭氏賈弟鞭毛蟲減少4個對數(shù)值。Korich等比較了臭氧、二氧化氯、氯對凈化水中的微小隱孢子蟲卵囊的滅活作用試驗證明，1ppm的臭氧作用5分鐘可以滅活90%的卵囊，1.3ppm的二氧化氯則需作用1小時，80ppm的氯則需作用1.5小時才能達到同樣效果。

臭氧殺菌消毒

臭氧殺菌機理以氧化作用破壞微生物膜的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)殺菌作用。臭氧對細菌的滅活反應總是進行的很迅速，與其它殺菌劑不同的是：臭氧能與細菌細胞壁脂類雙鍵反應,穿入菌體內(nèi)部，作用于蛋白和脂多糖，改變細胞的通透性，從而導致細菌死亡。臭氧還作用于細胞內(nèi)的核物質(zhì)，如核酸中的嘌呤和嘧啶破壞DNA。臭氧首先作用于細胞膜，使膜構(gòu)成成份受損傷而導致新陳代謝障礙，臭氧繼續(xù)滲透穿透膜而破壞膜內(nèi)脂蛋白和脂多糖，改變細胞的通透性，導致細胞溶解、死亡。臭氧滅活病毒則認為氧化作用直接破壞其核糖核酸RNA或脫氧核糖核酸DNA物質(zhì)而完成的。臭氧對病毒的作用首先是病毒的衣體殼蛋白的四條多肽鏈，并使RNA受到損傷，特別是形成它的蛋白質(zhì)。噬菌體被臭氧氧化后，電鏡觀察可見其表皮被破碎成許多碎片，從中釋放出許多核糖核酸，干擾其吸附到寄存體上。