別名:ARF, CDK4I, CDKN2, CMM2, INK4, INK4a, MLM, MTS1, TP16, p14, p14ARF, p16, p16INK4, p16INK4a, p19, p19Arf, CDK4 inhibitor p16-INK4|OTTHUMP00000021148|cell cycle negative regulator beta|cyclin-dependen

蛋白功能1:Cell Cycle

蛋白功能3:Cell cycle

靈敏度:4.69 pg/ml

Human CDKN2A ELISA kit     

【預期應用】ELISA 法定量測定血清、血漿、細胞培養(yǎng)物上清、組織裂解液中CDKN2A     含量。

【產(chǎn)品性能指標】

1、檢測范圍：15.6 pg/ml-1000 pg/ml

2、靈敏度：3.9 pg/ml

3、精密度：批內(nèi)差CV%<8%，批間差CV%<10%

Human CDKN2A ELISA kit     

【實驗原理】

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗CDKN2A     抗體的微孔中依次加入標本或標準品、

*化的抗CDKN2A     抗體、HRP 標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過

氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣本中的CDKN2A     呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣本濃度。

【試劑盒組成成分】

組份48T/96T

酶標板 (Assay plate) 12 條×8 孔

標準品 (Standard) 2 瓶 (凍干品)

*標記抗體 (Biotin-antibody) 1 x 120 μl/瓶 (100×)A

辣根過氧化物酶標記親和素 (HRP-avidin) 1 x 120 μl/瓶 (100×)

*標記抗體稀釋液 (Biotin-antibody Diluent) 1 x 15 ml/瓶

辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 (HRP-avidin Diluent) 1 x 15 ml/瓶

* (Sample Diluent) 1 x 50 ml/瓶

濃洗滌液 (Wash Buffer) 1 x 20 ml/瓶 (25×)

底物溶液 (TMB Substrate) 1 x 10 ml/瓶

終止液 (Stop Solution) 1 x 10 ml/瓶

板貼4

【所需試劑和器材】

標準規(guī)格酶標儀；高速離心機；電熱恒溫培養(yǎng)箱；干凈的試管和離心管；容量瓶；

系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭；多通道移液器；蒸餾水等

【樣本采集及保存】

1、血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4°C 過夜后于2 - 8°C 1000 x g 離心15 分鐘，取

上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于-20°C 或-80°C 保存，但應避免反復凍融。

解凍后的樣品應再次離心，然后檢測。

2、血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g 離心15

分鐘，取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反

復凍融。解凍后的樣本應再次離心，然后檢測。

3、細胞培養(yǎng)物上清：標本于2 - 8°C 1000 x g 離心15 分鐘取上清，上清立即用于實驗，或

分裝后于-20°C 或-80°C 保存。避免反復凍融。

4、組織裂解液：取100mg 組織，用1X PBS 洗去血污。剪成小塊放入組織研磨器（勻漿管）中，加入1 ml 1X PBS，制成勻漿，然后置于-20°C 過夜。經(jīng)過反復凍融2 次處理破壞細

胞膜后，將組織勻漿于2 - 8°C 5000 g 離心5 分鐘取上清。取適量上清液立即進行實驗，

或?qū)⑸锨宸盅b保存于-20°C 或-80°C 。解凍后的樣本應再次離心，然后檢測。避免反復凍

融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

【試劑配制】

1、 標準品

(1) 從試劑盒中取出一支標準品，于6000-10000rpm 離心30 秒。用1ml *溶解，并

用吸頭對準凍存管底部反復吸打5 次以助溶解，充分混勻得到標準品S7，放置備用。

(2) 取7 個1.5 ml 離心管(S0-S6)依次排列，各加入250μl *。吸取250μl 標準品

S7 到*個離心管中(S6)，輕輕吹打混勻。從S6 中吸取250μl 到第二個EP 管中(S5)，

輕輕吹打混勻。以此類推進行標準品的倍比稀釋。S0 為*。

2、 洗液工作液

濃洗滌液按1:25倍用去離子水進行稀釋。例如用量筒量取240ml去離子水，倒入燒杯或其

他潔凈容器中，再量取10ml濃洗滌液，均勻加入，攪拌混勻，在臨用前配妥。濃洗滌液低溫保

存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3、 *標記抗體工作液

*標記抗體液按1:100倍用*標記抗體稀釋液進行稀釋。如10μl*標記抗體加

990μl*標記抗體稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10分鐘內(nèi)配妥。

4、 辣根過氧化物酶標記親和素工作液

辣根過氧化物酶標記親和素按1:100倍用辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液進行稀釋。如

10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液，輕輕混勻，在臨用

前10分鐘內(nèi)配妥。

     【重要提示】

1、實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?。試劑或樣本稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起

泡。

2、用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便管蓋和管壁上的液體集中到

管底。

3、在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

4、 因?qū)嶋H裝量多于標示裝量，配制工作試劑請用精準的計量工具（移液器或量筒等）量取，

切勿不經(jīng)量取直接使用。

5、標準品、*標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液稀釋前根據(jù)預先計算

好的每次實驗所需的總量配制，實際配制時應多配制0.1-0.4ml。請勿重復使用已稀釋過

的標準品、*標記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。

6、標準品的稀釋請勿于板中進行，標準品應于臨用前15 分鐘內(nèi)配制。為保證實驗有效性，

建議每次實驗使用新的標準品。若保存得當，溶解后的標準品S7 可在2-8℃保存，7 天內(nèi)

使用有效。

     【操作步驟】

1、將各種試劑移至室溫（18-25℃）平衡至少30 分鐘，按前述方法配制試劑，備用。

2、加樣：分別設標準品孔、待測樣本孔。每孔分別加標準品或待測樣本100μl，輕輕晃動混

勻，覆上板貼，37℃溫育2 小時。

3、棄去液體，甩干，不用洗滌。

4、每孔加*標記抗體工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 小時。

5、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次。每次浸泡2 分鐘，200μl/每孔，甩干。

6、每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 小時。

7、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次。每次浸泡2 分鐘，200μl/每孔，甩干。

8、依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色15-30 分鐘。

9、依序每孔加終止溶液50μl，終止反應。

10、在反應終止后5 分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。

     【操作要點】

1、為保證檢測結(jié)果的準確性，建議標準品及樣本均設雙孔測定。每次檢測均需做標準曲線。

2、如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先用*進行稀釋，以使樣本符合試劑盒的檢測范

圍，zui后計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù)。

3、 加樣：加樣時，請使用一次性的潔凈吸頭，避免交叉污染。加樣時應盡量輕緩，避免起泡，

將樣本加于酶標板孔底部，切勿沿孔壁加樣。一次加樣時間控制在10 分鐘內(nèi)，如標

本數(shù)量多，*使用移液器加樣。

4、 溫育：為防止樣本蒸發(fā)或污染，溫育過程中酶標板必須覆上板貼，實驗過程中酶標板應避

免處于干燥的狀態(tài)。溫育過程中應隨時觀察溫箱溫度是否恒定于37℃，及時調(diào)整。溫育

過程中，溫箱不易開啟太多次，以免影響溫度平衡。

5、 洗滌：洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

(1) 手工洗板方法：吸去（不可觸及孔壁和孔底）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪

墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將*的洗滌緩沖液按200μl/孔注入孔內(nèi)，

浸泡2 分鐘。根據(jù)操作步驟中所述，重復此過程數(shù)次。

(2) 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

6、 顯色：為保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液?？稍诩尤氲孜锶?/span>

液后每隔一段時間觀察一下顯色情況以控制反應時間（比如每隔10 分鐘）。當肉眼可見標

準品前3-4 孔有明顯梯度藍色，后3-4 孔顯色不明顯時，即可加入終止液終止反應，此時

藍色立刻變?yōu)辄S色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。

7、底物溶液應為淺藍色或無色，如果顏色嚴重變深則必須棄用。底物溶液易受污染，請避光

妥善保存。

     【數(shù)據(jù)處理】

可將標準品及樣本值減去S0 孔數(shù)值后繪制曲線，如果設置復孔，則應取其平均值計算。以標

準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標），OD 值為橫坐標（對數(shù)坐標），在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲

線。*使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，可從我們的下載專業(yè)軟件"Curve Expert 1.3"，

并根據(jù)提示制作標準曲線。根據(jù)樣本OD 值，由標準曲線查出相應的濃度；或用標準品的濃度

與 OD 值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣本的OD 值代入方程式，計算出樣本濃度。若樣

本檢測前進行過稀釋，zui后計算時需乘以相應的稀釋倍數(shù)，即為樣本的實際濃度。

     【說明】

1、本試劑盒僅供研究使用。

2、中、英文說明書可能會有不*之處，請以英文說明書為準。

3、本操作說明也適用于48T 試劑盒。48T 試劑盒中酶標板、標準品、*標記抗體及辣根

過氧化物酶標記親和素數(shù)量減半。

4、不同批號試劑不能混用。不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

5、剛開啟的酶標板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何

影響。

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