細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(B-AI)試劑盒微板法
細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(B-AI)試劑盒微板法
本試劑盒僅供科研使用 1 細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（B-AI）試劑盒說明書 （貨號：WS8150W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 蔗糖酶即蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，E.C.3.2.1.26）在蔗糖代謝中催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖，是高等 植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一。根據(jù)最適 PH 值，蔗糖轉(zhuǎn)化酶分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）兩 種類型，許多報道均將中性轉(zhuǎn)化酶同堿性轉(zhuǎn)化酶看作一種轉(zhuǎn)化酶。 AI 的最適 pH 為 3.0～5.0，AI 分為可溶性 AI(S-AI)和細(xì)胞壁不溶性 AI（B-AI：cell-wall binding acid invertase）兩種類型，前者分布在液泡中或細(xì)胞自由空間，后者存在于細(xì)胞間隙并結(jié)合在細(xì)胞壁上。B-AI 主要參與韌皮部質(zhì)外體卸載時蔗糖的分解，以維持庫源之間蔗糖的濃度。 B-AI 催化蔗糖降解產(chǎn)生還原糖，進(jìn)一步與 3,5－二硝基水楊酸反應(yīng)，生成棕紅色氨基化合物，經(jīng)光譜 掃描在 540nm 有特征光吸收，在一定范圍內(nèi) 540nm 光吸收增加速率與 B-AI 活性成正比。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 A 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 提取液 B 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前加入 7.5mL 試劑一充分溶解 備用；用不完的試劑 4℃保存; 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（B-AI）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 按照組織質(zhì)量（g）：提取液 A 體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液 A），進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 10min，棄上清，留沉淀。 ② 沉淀中加入 1mL 蒸餾水，震蕩混勻，12000rpm4℃離心 10min，棄上清，留沉淀。 ③ 沉淀中加入 1mL 提取液 B 充分混勻，4℃浸提過夜，12000 rpm 4℃離心 20min，取 上清置冰上待測。 2、上機(jī)檢測： 1 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 40 40 試劑一 100 200 試劑二 100 混勻， 37℃準(zhǔn)確水浴 20min 后，95℃水浴 10min（用封口膜纏緊， 以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變） 試劑三 100 100 混勻，95℃水浴 10min（用封口膜纏緊，以防止水分散失），流水冷本試劑盒僅供科研使用 2 卻后充分混勻，吸取 200μL 轉(zhuǎn)移至 96 孔板中，540nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測定-A 對照（每個測定管需設(shè)一個對照管）。 【注】：1.若吸光值大于 1.5，可以用蒸餾水稀釋樣本后測定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù) D。 2.若ΔA 值在零附近徘徊，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 80μL，則試劑一相應(yīng)減少），或延 長 37℃水浴時間（如增至 40min 或更長），則相應(yīng)的 V1 和 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 0.007x - 0.0234；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(B-AI)(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0234)÷0.007]÷(V1×Cpr)÷T×D =178.6×(ΔA+0.0234)÷Cpr×D 3、按鮮重計(jì)算： 單位定義：37℃每克組織每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(B-AI)(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0234)÷0.007]÷(W×V1÷V)÷T×D =178.6×(ΔA+0.0234)÷W×D V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL； T---反應(yīng)時間，20min； W---樣本鮮重，g。 D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（5mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 按照：40μL 標(biāo)準(zhǔn)品+200μL 試劑一+100μL 試劑三，依次加樣操作，95℃水浴 10min， 冷卻后，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下測定，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
