產(chǎn)品簡介：

細(xì)胞培養(yǎng)具體步驟：

一、常用設(shè)備

1. 準(zhǔn)備室的設(shè)備

單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。

2. 培養(yǎng)室的設(shè)備

液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80℃）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。

3. 必須放在無菌間的設(shè)備

離心機（收集細(xì)胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。

二、無菌操作

（一）無菌室的滅菌

1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或新潔爾滅或0.5％過氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射。

3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘。

4.實驗后滅菌：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

01 原代培養(yǎng)操作步驟

原代培養(yǎng)的操作步驟為：取材→分離→培養(yǎng)。

（1）取材：對于不同的組織有不同的取材方法，但均應(yīng)保持材料的新鮮及嚴(yán)格無菌。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作步驟如下：

（1）傳代前在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長密度，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%~90%時，即可進(jìn)行傳代。

（2）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液。加入PBS清洗1~2次，左右輕輕搖晃后棄掉。

（3）根據(jù)培養(yǎng)瓶大小向瓶內(nèi)加入適量含EDTA的，一般應(yīng)覆蓋整個培養(yǎng)瓶底。

（4）把培養(yǎng)瓶放入37℃ CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行消化，2~5min后拿出放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有70%~80%細(xì)胞收縮變圓、細(xì)胞間隙變大時，再輕輕拍打培養(yǎng)瓶使剩余細(xì)胞脫落，然后立即加入2倍量的培養(yǎng)液中止消化，使用吸頭輕輕吹打，混合均勻，以防消化過度。

（5）吸出所有細(xì)胞懸液至離心管內(nèi)，1000rpm/min離心3~5min。

（6）棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞均勻分散。

（7）用吸頭吸取適量細(xì)胞懸液，以適宜的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)液，搖勻，放置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

（8）根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)確定換液或傳代時間，甚至進(jìn)行細(xì)胞凍存。

注意事項：

（1）嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，所用一切試劑及耗材均應(yīng)無菌，且須在無菌超凈工作臺中紫外照射30min以上，以免細(xì)胞發(fā)生污染。

（2）所用培養(yǎng)液必須適宜細(xì)胞生存和生長。來源于不同動物種類、組織類型的細(xì)胞，對培養(yǎng)液的要求不一樣，必要時可用預(yù)實驗的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液。

（3）胎牛血清對于維持細(xì)胞生存，促進(jìn)細(xì)胞生長起著關(guān)鍵作用?？筛鶕?jù)文獻(xiàn)或預(yù)實驗選擇合適的胎牛血清。一旦確定，就應(yīng)保持用至實驗完成。

（4）消化細(xì)胞時應(yīng)避免消化時間過短導(dǎo)致消化不，收集到的細(xì)胞數(shù)量少，或消化時間過長導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)塊樣絮狀游離，這時的細(xì)胞已有損傷或死亡，影響細(xì)胞數(shù)量和實驗進(jìn)度。

（5）細(xì)胞離心的時候應(yīng)避免離心力過小收集的細(xì)胞數(shù)量不夠，或離心力過大對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。離心后的細(xì)胞沉淀棄去上清后，應(yīng)先彈散細(xì)胞沉淀，再加入培養(yǎng)液重懸，這樣比直接吹打?qū)?xì)胞損傷小，可以提高細(xì)胞活率。

（6）吹打細(xì)胞時應(yīng)盡量避免細(xì)胞的產(chǎn)生，以免損傷細(xì)胞，影響細(xì)胞狀態(tài)（吹打過程中殘留部分液體在吸頭內(nèi)可以減少氣泡的產(chǎn)生）。

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