蛋白免疫印跡（Western Blot）采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物(NC膜，PVDF膜等)上后，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對(duì)應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，一抗再與酶標(biāo)記的二抗起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測(cè)特異蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
由于Western blot技術(shù)服務(wù)具有簡(jiǎn)便，快捷等特點(diǎn)，所以目前該技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)。
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| 蛋白免疫應(yīng)印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)服務(wù)項(xiàng)目 | |
| 蛋白質(zhì)抽提與定量 | Western Blot |
| 圖片分析 | Western Blot實(shí)驗(yàn)服務(wù)報(bào)告提交 |
Western blot實(shí)驗(yàn)步驟
1、Western blot蛋白質(zhì)提取：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌x擇不同的裂解液，如RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液，同時(shí)根據(jù)蛋白質(zhì)提取組分的不同選擇不同的方法，如提取核蛋白，細(xì)胞質(zhì)蛋白，膜蛋白等。
2、蛋白定量：根據(jù)蛋白質(zhì)的提取條件不同，可采取不同的定量方法，如bradford法、BCA法等。
3、電泳：依據(jù)需要檢測(cè)蛋白的分子量選取分離膠的濃度，分別配置分離膠和積成膠，凝膠凝固后進(jìn)行蛋白質(zhì)上樣和電泳。
4、轉(zhuǎn)膜：可采取半干法和濕法轉(zhuǎn)移，當(dāng)采取半干法轉(zhuǎn)膜時(shí)需防止短路：從下到上的順序：濾紙/PVDF膜/凝膠/濾紙/陰極(bio-rad轉(zhuǎn)膜儀)。
5、封閉：5%脫脂奶粉或5% BSA封閉過夜或室溫1小時(shí),孵育時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行改變。
6、一抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時(shí)或4度過夜，孵育時(shí)間可參考抗體說明書，并加以優(yōu)化，一抗孵育后TBST洗膜3次，每次5分鐘。
7、二抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時(shí)，TBST洗膜3次，每次5分鐘。
8、顯影(ECL法)：將A、B兩種底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上，置于壓片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒進(jìn)行曝光，曝光一定時(shí)間后取出膠片，浸入顯影液中顯影，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶，清水漂洗一下后放在定影液中至底片定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，掃描膠片和Western blot 圖片分析。
Western blot實(shí)驗(yàn)送檢要求
新鮮或正確保存的組織、細(xì)胞或蛋白樣品。
組織樣品：每份樣品約２５０～５００ｍｇ，１０－１５ｍｇ／ｍｌ；
細(xì)胞樣品：每份樣品約１×１０６～１×１０７ 細(xì)胞數(shù)，濃度＞１μｇ／μｌ；
蛋白樣品：裂解樣品總蛋白量＞５００μｇ／樣品，濃度≥２μｇ／μｌ。
菲優(yōu)特檢測(cè)秉承“科學(xué) · 獨(dú)立 · 誠(chéng)信 · 高效”的服務(wù)理念，以專業(yè)、專注的態(tài)度為您提供精確的檢測(cè)技術(shù)和咨詢服務(wù)。
